RT-PCR检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法

摘要

本发明提供RT‑PCR检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法。以样品总RNA反转录成的cDNA为模板，利用PCR引物组合进行PCR扩增，得到XDH/XO基因片段的扩增产物的灰度值与内参基因GAPDH PCR扩增产物的灰度值之比,根据所得灰度值之比即可计算出不同生理状况下XDH/XO mRNA的相对表达值，并根据所计算的相对表达值的大小半定量检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平，为研究树鼩黄嘌呤氧化酶功能以及相关药物对其影响提供了有效途径。本发明适用于半定量RT‑PCR检测，其费用低、操作简单，可重复性高，检测成本低、特异性和灵敏性好。

主权项

一种用于非诊断目的的RT‑PCR检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法，其特征在于包括下列步骤：1 ） 设计下列引物：树鼩 X D H / X O 基因表达水平的特异性上、下游引物组合及对应的核苷酸序列为：X D H / X O F：5’‑GTTGGAGGGAACATCATCACT‑3’X D H / XO R：5’‑GCAGGGTCTTTCTGTAGCCA‑3’；作为内参基因的树鼩G A P D H 基因的特异性上、下游引物及对应的核苷酸序列为：G A P D H F：5’‑CAAGAAGGTAGTGAAGCAGGC‑3，GAPDH R：5’‑TGTTGAAGTCGGAGGAGACC‑3’；2 ）以树鼩新鲜肝脏组织提取的总RNA为模板，按常规逆转录合成得树鼩肝脏组织cDNA第一链；3 ）以步骤2）逆转录合成的树鼩肝脏组织cDNA第一链为模板，以步骤1）中的X D H / X O F和X D H / X O R以及G A P D H F和G A P D H R为特异性引物，分别在下列PCR 扩增体系下：25μL 体系，Premix Taq 12.5μL，10μmol/L 上、下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，8.5μL 去离子水，进行下列PCR扩增：94 ℃预变性 5 min， 98℃变性10S，58℃退火30S，72℃延伸1min，共35个循环， 72 ℃延伸 10 min，分别得到特异的X D H / X O 和G A P D H 的扩增产物；4 ）将步骤3）获得的XDH/XO和G A P D H 的扩增产物按常规分别经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，分别获得目的基因片段，并在凝胶影像分析仪上分别获得基因条带图像，用Quantity one软件对所获基因条带进行灰度分析，分别得到X D H / X O 基因条带灰度值和G A P D H 基因条带灰度值；5 ）根据步骤4）得到X D H / X O 基因条带灰度值和G A P D H 基因条带灰度值之比，计算出X D H / X O mRNA相对表达值，根据该相对表达值的大小判定树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平。