钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法

摘要

本发明涉及一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，属于生物技术领域。具体步骤是分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即对照组(不施钾组)和处理组(施钾组)，施钾组所施钾肥为硫酸钾。处理的马铃薯植株包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理。对桃蚜种群数量观察记录，并测定不同马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂活性以及与抗虫相关的酶活性。6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，对此利用iTRAQ技术研究不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制。本发明充分发挥马铃薯的自然抗性和诱导抗性，揭示了钾肥增强马铃薯的抗虫机理，对开展蚜虫生态调控具有重要意义。

主权项

一种钾肥对虫害马铃薯蛋白组学影响的研究方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、分别选取长势一致、具有两片叶子的马铃薯，将其分为2组，即不施钾组的对照组和施钾的处理组，施钾组所施钾肥为硫酸钾，其用量按最低施钾量75000株/公顷马铃薯计算；每组分为4个施钾水平，所施硫酸钾分别为0、4、6和8g/株；S2、自然条件下生长2个月后，随机选取一半对照组和处理组植株，在每株上接桃蚜5头，接虫枝用80目的纱网罩住，以防止昆虫迁出；上述处理中，除0g/株仅为对照和接虫两种处理外，其余3种施钾水平处理的马铃薯植株则包括对照、施钾、接虫、施钾+接虫4种处理；每组处理重复20次；在此期间，对桃蚜种群数量进行观察记录，并测定不同处理马铃薯叶片中茉莉酸含量、蛋白酶抑制剂(PI)活性以及一些与抗虫相关的酶活性；S3、针对结果分析比较发现，6g/株施钾量对桃蚜的抑制效果最为强烈，故在上述研究的基础上，利用iTRAQ技术研究不同处理后马铃薯叶片中蛋白组学的表达，阐明施钾对马铃薯诱导防御的影响机制，蛋白的提取和鉴定过程如下：(1)蛋白的提取与消化：采用丙酮沉淀法提取蛋白，其过程大致为：分别取上述四种处理的马铃薯植株叶片，加入TCA‑冰丙酮冰浴研磨，‑20℃沉淀2h，4℃、30000g离心30min，取沉淀，再加入预冷的纯丙酮清洗沉淀，‑20℃沉淀30min，4℃、20000g离心30min，取部分沉淀加入1.5mL离心管中，加至0.1～0.5的刻度之间即可，加入配置好的SDS复溶Buffer，超声5min助溶，离心25min，取上清100μL，加入DTT至终浓度10mmol/L，56℃水浴1h，迅速加入IAM至终浓度55mmol/L，暗室静置1h，加入4倍于样品溶液体积的预冷丙酮，‑20℃沉淀3h，4℃20000g离心20min，取沉淀，加入50μL的1％SDS复溶沉淀，用水稀释至250μL，超声3min助溶，使用2D‑Quant Kit定量；每个样品取100μg体积，加入等体积的水∶TEAB＝1∶1的纯TEAB，用含0.1％SDS的TEAB补齐所有样品体积，加入1μg/μL的Trypsin，每100μg蛋白质底物加入3.3μg的酶，37℃水浴24h，然后补加Trypsin1μg，37℃12h，冻干消化液，然后使用水∶TEAB＝1∶1，含0.1％SDS的TEAB每管50μL复溶肽段，取1μL消化后肽段，使用MALDI Tof/Tof检测消化效率；(2)iTRAQ试剂标记肽段：标记试剂平衡至室温，每管标记试剂中加入70μL异丙醇，混匀，离心甩至管底，将混好的标记试剂加入到肽段中，混匀后甩至管底，室温静置2h，MALDI检测标记效率；(3)micro‑Tof‑Q检测肽段信号：标记后样品稀释后调pH至3.0，用0.22μm有机膜过滤，经排气、清洗、平衡至压力后，即可在HPLC中上样，收集样品，通过C₁₈反相色谱除盐，20μL0.1％甲酸复溶，取0.8μL样品点靶，LC‑MS/MS分析，根据分析结果，mascot软件可根据数据库中提供的蛋白质理论酶解肽段信息，与实际检测到的进行比对，从而得到鉴定结果；(4)Western blotting：蛋白样品SDS‑PAGE电泳后，电转为100v，90min，10％脱脂奶粉，封闭4℃过夜，加一抗，37℃1h，TBST漂洗3次，每次10min；加HRP标记的羊抗兔IgG，37℃40min，TBST漂洗3次，每次10min，AB发光液混合后，滴入膜上显影，BIORAD凝胶成像仪照片、保存；Western杂交后，采用目的条带和内参条带的比值计算不同处理条件下几种与抗虫相关的蛋白比率。