同时测定组织中两种马兜铃酸-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析方法

摘要

本发明涉及一种检测马兜铃酸肾病(AAN)生物标记物，即马兜铃酸(AA)-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析法。该法利用AA-DNA加合物的荧光特性，HPLC-FLD检测AA-DNA加合物、HPLC-DAD检测脱氧核苷，从而测定加合物含量；可同时测定脱氧腺苷-马兜铃酸I加合物(dA-AA-I)、脱氧腺苷-马兜铃酸II加合物(dA-AA-II)，AAN最主要的两种加合物。主要步骤有DNA的提取、DNA的消化及加合物的富集、HPLC-FLD测定AA-DNA加合物、HPLC-DAD测定脱氧腺苷、AA-DNA加合物含量的计算。应用该法，在给予关木通等含有AAs的药物或食物的动物组织(例如大鼠肝、肾组织等)可检测AA-DNA加合物含量。

主权项

一种检测马兜铃酸肾病(AAN)生物标记物，即马兜铃酸(AA)‑DNA加合物的HPLC‑FLD‑DAD法，其特征在于，该法可同时测定动物组织中脱氧腺苷‑马兜铃酸I加合物(dA‑AA‑I)、脱氧腺苷‑马兜铃酸II加合物(dA‑AA‑II)，这两种AAN最主要的加合物；该法利用AA‑DNA加合物的荧光特性，用HPLC‑FLD检测AA‑DNA加合物、用HPLC‑DAD检测脱氧核苷，从而测定加合物含量，该方法含有如下步骤：(1)DNA的提取：采用苯酚氯仿法提取动物组织中DNA；(2)DNA的消化及加合物的富集：取200μgDNA在Tris缓冲液弱碱性环境中，分别按顺序加入三种酶在37℃孵育反应，即30μL DNase I、4μL磷酸二酯酶I、4μL碱性磷酸酶，消化完后用乙酸乙酯萃取，富集加合物；(3)HPLC‑FLD测定AA‑DNA加合物：FLD激发波长在280～430nm，发射波长在450～600nm，流动相为0.2％乙酸‑水(A)、乙腈(B)，B相0～20min在25％～40％范围内梯度变化，20～45min在40％～80％范围内梯度变化；(4)HPLC‑DAD测定脱氧腺苷：DAD检测波长在250～260nm，流动相为水(A)、乙腈(B)，B相0～35min在5％～80％范围内梯度变化；(5)AA‑DNA加合物含量的计算：AA‑DNA加合物浓度以每10⁵正常脱氧核苷中的加合物数量表示。