一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法

摘要

本发明采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法对两个或者两个以上位点变化（如SNP，突变等）的PCR产物（多个DNA模板）进行单体型分析，PCR产物被特定测序引物杂交后分成两份，各自加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸，然后对未封闭的引物继续合成测序，得到特定DNA模板的序列信息,从而确定PCR产物的单体型。

主权项

一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于：一段核酸序列的待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：步骤一扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；步骤二DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；步骤三测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；步骤四测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，即ddNTPs或3’‑O‑烯丙基、3’‑O‑氰乙基、3’‑O‑叠氮甲基修饰的核苷酸之一，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；步骤五测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；步骤六DNA模板单体型的确定：根据步骤五测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。