一种艾塞那肽的固相合成方法

摘要

本发明涉及一种艾塞那肽的新的合成方法，以MBHA/AM resin为起始原料，以linker、氨基酸或二肽、三肽为主要原料进行合成，以DIC/HoBt、DIC/HoAt为缩合试剂进行缩合延长肽链，采用脱保护试剂脱除Fmoc基团，重复氨基酸偶联，脱Fmoc，氨基酸偶联，脱Fmoc的过程得到艾塞那肽的肽树脂，裂解全保护的艾塞那肽肽树脂得到艾塞那肽粗品，最后高效液相色谱法进行纯化得到艾塞那肽的成品。本发明通过Fmoc‑(Hmb)Leu²¹‑OH的引入有效缓解了肽链Ser¹¹‑Val¹⁹间的β折叠的情况，并通过Fmoc‑Pro³⁶‑Pro³⁷‑Pro³⁸–OH片段的引入有效减少了逐步连接Pro³⁶‑Pro³⁷‑Pro³⁸过程中De‑Pro的杂质，最后采用Fmoc‑His‑Gly‑OH的引入减少了（D‑His¹）以及（De‑Gly²）、（+Gly)的杂质，从而降低了分离纯化时的难度，大大提高了产品收率和纯度。

主权项

一种艾塞那肽的固相合成方法，包括步骤如下：1）制备Fmoc‑His‑Gly‑OH.HCl：将原料Fmoc‑His(Trt)‑OH溶于无水DCM中，再加入1.5eq的EDCI，HoSu在氮气保护下，搅拌10‑24hrs；然后水洗，饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥得到Fmoc‑His(Trt)‑Osu，将得到的Fmoc‑His(Trt)‑Osu用THF溶解，滴加到含有1.2eq的H‑Gly‑OH的碳酸氢钠水溶液中，反应2‑6hrs，过滤，旋蒸，然后用磷酸水溶液调节pH值到3~4，DCM萃取，后有机相酸洗，水洗，饱和食盐水洗涤，干燥后得到Fmoc‑His(Trt)‑Gly‑OH用4N的盐酸乙酸乙酯处理2‑4hrs，旋干后，过层析柱纯化得到Fmoc‑His‑Gly‑OH.HCl；2）制备全保护的艾塞那肽肽树脂：选择AM resin或者MBHA resin为树脂原料，选择linker、氨基酸或二肽、三肽为主要合成原料；以HBTU/DIEA，DIC/HoBt或DIC/HoAt为缩合试剂进行缩合延长肽链将Fmoc‑Linker或者Rink amide linker 连接到AM resin或MBHA resin上，采用脱保护试剂脱除Fmoc基团，重复氨基酸偶联，脱Fmoc，氨基酸偶联，脱Fmoc的过程，逐步连接氨基酸或片段，依次偶联的氨基酸为：Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Pro‑Pro‑Pro‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Gly‑Gly‑OH、Fmoc‑Asn(Trt)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Trp(Boc)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑(Hmb)Leu‑OH、Fmoc‑Arg(pbf)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Ser(tBu)‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑Thr(tBu)‑OH、Fmoc‑Gly‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑His‑Gly‑OH；连接过程中用茚三酮检测检测反应终点，茚三酮检测成阴性说明连接完全；其中，每步氨基酸的偶联按照相同的连接方式偶联，每次偶联试剂及氨基酸需要在冰水浴中预活化，再进行连接；最后得到艾塞那肽的全保护肽树脂：His¹‑Gly²‑Glu³(OtBu)‑Gly⁴‑Thr⁵(tBu)‑Phe⁶‑ Thr⁷(tBu)‑Ser⁸(tBu)‑Asp⁹(OtBu)‑Leu¹⁰‑Ser¹¹(tBu)‑Lys¹²(Boc)‑Gln¹³(Trt)‑Met¹⁴‑Glu¹⁵(OtBu)‑Glu¹⁶(OtBu)‑Glu¹⁷(OtBu)‑Ala¹⁸‑Val¹⁹‑Arg²⁰(pbf)‑(Hmb)Leu²¹‑Phe²²‑Ile²³‑Glu²⁴(OtBu)‑Trp²⁵(Boc)‑Leu²⁶‑Lys²⁷(Boc)‑Asn²⁸(Trt)‑Gly²⁹‑Gly³⁰‑Pro³¹‑Ser³²(tBu)‑Ser³³(tBu)‑Gly³⁴‑Ala³⁵‑Pro³⁶‑Pro³⁷‑Pro³⁸‑Ser³⁹(tBu)‑rink amide AM resin/MBHA resin3）裂解全保护的艾塞那肽肽树脂：将上述步骤2）中得到的艾塞那肽的全保护肽树脂经过裂解液裂解，并用少量切割液洗涤树脂，最后经甲基叔丁基醚沉淀后得到艾塞那肽的粗品；4）纯化艾塞那肽粗品：艾塞那肽粗品用10%的醋酸水溶液溶解，溶液用0.45μm的微孔过滤膜过滤，待用；采用高效液相色谱法进行纯化，经过两步纯化一步换盐得到艾塞那肽的成品。