一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其是在活性端粒酶存在时，其底物的延长产物能够与辅助DNA进行杂交，释放多个引发DNA，引发DNA能够引发发夹DNA探针H1和H2发生自组装链替代反应，在H1:H2的两个末端分别形成G‑四链体，氯化血红素(hemin)与G‑四链体作用，形成具有催化活性的G‑四链体DNA酶，催化TMB‑H₂O₂体系发生反应，溶液颜色由无色变为蓝色，在加入酸时溶液被氧化为黄色，活性端粒酶的加入，会使溶液颜色发生变化，实现端粒酶活性的可视化检测，同时还可以测定溶液的紫外吸收光谱，更准确，灵敏的测定端粒酶的活性。

主权项

一种基于链替代反应的比色法检测端粒酶活性的方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)待检细胞裂解提取端粒酶，将所提取的端粒酶提取液与端粒酶底物一起加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液中，30～37℃孵育0.5～2小时，得到待检液体系；(2)用浓度为50mmol/L、pH＝7.0且含5mmol/L MgCl₂的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液将发夹DNA探针H1、发夹DNA探针H2和单链A‑DNA、单链T‑DNA分别稀释至浓度为20μmol/L，制得H1溶液、H2溶液、A‑DNA溶液以及T‑DNA溶液，将H1溶液和H2溶液置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用；(3)将步骤(2)配制的A‑DNA溶液与T‑DNA溶液等体积混合，得到AT‑DNA溶液，将其置于离心管中，水浴加热到80～90℃保持5～10分钟，自然冷却至室温，于4℃以下保存，备用；(4)向浓度为50mmol/L、pH＝7.4且含有5mmol/L MgCl₂、5mmol/L KCl的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液中加入端粒酶重复序列扩增缓冲溶液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液和步骤(3)制得的AT‑DNA溶液，使最终100μL的混合体系中H1、H2、AT‑DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；(5)向与步骤(4)等量的三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲溶液中加入步骤(1)的待检液，混匀，向该混合体系中加入步骤(2)的H1溶液、H2溶液以及步骤(3)制得的AT‑DNA溶液，使最终的100μL混合体系中H1、H2、AT‑DNA的浓度分别为150nmol/L、200nmol/L、50nmol/L，30～37℃孵育30～60分钟；(6)向步骤(4)和步骤(5)的混合体系中分别加入浓度为1μmol/L的氯化血红素溶液和浓度为0.5mol/L的KCl溶液，室温孵育10～15分钟；(7)用浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液和0.2mol/L Na₂HPO₄配制pH为5.2的柠檬酸‑Na₂HPO₄缓冲溶液，将浓度为1.0mg/mL的TMB底物液和柠檬酸‑Na₂HPO₄缓冲溶液以及体积浓度为30％H₂O₂按照体积比100：900：1新鲜配制成TMB显色液，向步骤(6)的两个混合体系中分别加入TMB显色液，室温下反应30～40分钟，再分别加入2mol/L的H₂SO₄溶液，目测观察两个混合体系的颜色变化，若步骤(5)对应的混合体系的颜色比步骤(4)对应的混合体系的颜色更深，则步骤(5)加入的待检细胞有活性端粒酶；否则，待检细胞中无活性端粒酶，从而完成待检细胞中端粒酶的检测。