人β‑防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法

摘要

本发明公开了人β‑防御素3基因果蝇生殖系统特异表达载体的制备方法，通过构建重组载体NosP‑attB，人β‑防御素3基因片段的制备及扩增，然后将人β‑防御素3基因片段插入到pet28a载体中，制备pet28a‑hBD‑3重组载体；再以pet28a‑hBD‑3重组质粒为模板，PCR扩增His‑hBD‑3片段；将His‑hBD‑3片段插入到NosP‑attB质粒中，制备果蝇生殖系统表达载体NosP‑attB‑His‑hBD3。该载体可以在果蝇生殖系统内特异高效表达，为下一步利用果蝇生殖系统大量表达人防御素3蛋白奠定基础，该方法的公开填补了目前尚无人β‑防御素3昆虫表达载体构建方法的空白。

主权项

重组载体NosP‑attB的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(a)以NosP‑ote载体为模板，P1、P2为特异性引物，PCR扩增Nos启动子的基因片段；所述P1、P2的基因序列如下：P1：5’‑tttcctgcagggaattcctcgagaccggtcgaccgttttaacctcgaaatatgcac‑3’；下划线字母表示Sbf1酶切位点；P2：5’‑aaatctagagcggccgctggtaccggcgcgccgtaactaaactcgcttttgggttaa‑3’；下划线字母表示Xba1酶切位点。(b)将步骤(a)得到的PCR产物和pUAST‑attB载体质粒用sbf1与xba1双酶切，载体加入CIAP，37℃孵育30分钟，去除DNA末端的5’磷酸根基团，然后用T4连接酶将目的片段与UAST‑attB载体进行连接，经过转化、鉴定后即可得到重组载体NosP‑attB。