发明名称 |
一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法 |
摘要 |
本发明公布了一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,该方法通过对多物种进行同源对比选取两对MSTN基因靶序列,利用gRNA的PAM设计原则,合成两对靶序列不同,表达的蛋白相同,带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链,将双链与pPDNA330质粒进行连接得到携带有多物种的MSTN同源基因的重组载体,重组载体利用荧光蛋白表达法对基因敲除效率进行检测,选择敲除效率更高的载体转染多物种受体细胞,进行基因敲除并验证,完成对多物种MSTN基因进行简单、高效、精确的基因敲除。 |
申请公布号 |
CN106119283A |
申请公布日期 |
2016.11.16 |
申请号 |
CN201610470813.6 |
申请日期 |
2016.06.24 |
申请人 |
广西壮族自治区水牛研究所 |
发明人 |
朱鹏;梁贤威;庞春英;邓廷贤;段安琴;陆杏蓉 |
分类号 |
C12N15/85(2006.01)I;C12N15/65(2006.01)I |
主分类号 |
C12N15/85(2006.01)I |
代理机构 |
北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340 |
代理人 |
但玉梅 |
主权项 |
一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除MSTN基因的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)构建pPDNA330‑MSTN‑1和pPDNA330‑MSTN‑2载体,构建方法如下:A、从基因数据库中下载多物种MSTN基因的核苷酸序列,并进行同源比对选取两对靶序列,分别为MSTN靶序列1:5’‑AGGCACTGGTATTTGGCAGAG‑3’和MSTN靶序列2:5’‑AAGATATAAGGCCAATTACTGCTC‑3’;B.根据同源对比结果和gRNA的PAM设计原则,合成两对与靶序列不同,表达的蛋白相同,带有相同BsmBI粘性末端的DNA双链,分别命名为:MSTN‑1和MSTN‑2;C.用BsmBI酶切pPDNA330质粒,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,再进行切胶回收;D.用连接酶将MSTN‑1和MSTN‑2分别与BsmBI酶切后的pPDNA330质粒进行连接,得到重组质粒载体,分别命名为:pPDNA330‑MSTN‑1和pPDNA330‑MSTN‑2;(2)对重组质粒载体pPDNA330‑MSTN‑1和pPDNA330‑MSTN‑2进行敲除效率的筛选验证、对比,选择MSTN基因敲除效率更高的重组质粒载体转染受体细胞;(3)转染不同物种的受体细胞,收集转染之后的受体细胞,并提取细胞基因组进行测序,根据基因组测序结果合成检测引物进行PCR扩增,扩增产物连接入pEASY‑T1载体,挑取单克隆细菌,进行测序,对MSTN基因敲除表达结果进行检测。 |
地址 |
530001 广西壮族自治区南宁市兴宁区邕武路24号 |