一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法

摘要

本发明涉及动物细菌学领域，提供了一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，该方法以小鼠抗α毒素单克隆抗体为基础，建立了特异性高、重复性好、背景低，可直观、简便检测α毒素的Envision免疫组化方法。该方法可用于除鼠以外动物组织中产气荚膜梭菌α毒素的检测，也为该毒素在动物机体内的分布检测提供了有效、可靠的手段。

主权项

一种产气荚膜梭菌病α毒素Envision免疫组化的检测方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)产气荚膜梭菌α毒素的制备:A型产气荚膜梭菌菌种接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落进行液体硫乙醇厌氧增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于产毒培养基中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；(2)人工感染家兔产气荚膜梭菌病选取1.0‑1.5Kg刚断奶后家兔6只，随机分成实验组和对照组，3只/组，实验组肌肉注射上述除菌α毒素3mL，对照组注射等量的生理盐水，72h内观察动物发病状况；实验组在其死亡时，立即进行临床剖检病变，并取病变组织，投入改良Bouin’S液固定液中，用于后续的组织切片制备和免疫组化染色；对照组同时进行；(3)组织切片的制备组织于固定液48h后，将组织用刀片切成1cm³的组织块，组织块经流水冲洗完固定液后，再进行常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片，切片于37℃温箱烤干，放置4℃备用后续免疫组化染色；阴性对照组组织同时进行此方法操作；(4)Envision免疫组化检测①阴性对照与阳性对照的组织切片于4℃冰箱拿出，在室温放置无水雾后，放置37℃温箱30min，使组织粘的更牢固，再脱蜡；②上述切片依次经二甲苯Ⅰ、Ⅱ，体积比1:1的二甲苯：100％酒精混合物，各常规脱蜡6min，再经100％酒精，95％酒精，90％酒精，80％酒精，70％酒精，蒸馏水，各水化处理4min；③上述切片在0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液90℃微波修复4次，5min/次，每次间隔4min，暴露出抗原表位，自然冷却至室温，其中所述的0.01M pH 6.0柠檬酸盐缓冲液成分为：1L去离子水、柠檬酸0.378g、柠檬酸三钠2.412g；④上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，将H₂O₂用PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒避光封闭1h；⑤上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，小牛血清经PBS缓冲液稀释至10％，滴加覆盖在组织上，37℃湿盒孵育50min；⑥甩去组织上的血清，小鼠抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12经PBS缓冲液按体积比稀释至1/600，滴加覆盖在组织上，湿盒内孵育，4℃过夜转37℃湿盒孵育30min；⑦上述切片于经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，滴加即用型超敏抗小鼠酶标二抗各试剂，37℃湿盒孵育50min；⑧上述切片经PBS缓冲液漂洗3次，5min/次，DAB室温下显色50‑60s，切片再用去离子水充分洗涤，终止显色反应；⑨上述切片经苏木素复染1.5min，去离子水冲洗至切片不脱色；⑩1％盐酸无水乙醇溶液进行分化3s，之后切片在去离子水中冲洗返蓝15min；最后组织切片经过上行酒精脱水﹑二甲苯透明﹑中性树胶封片，显微镜观察；上述使用的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾：0.27g、磷酸氢二钠：1.42g、氯化钠：8g、氯化钾0.2g；结果判定标准的确定：按照普通光学显微镜视野下观察到的特定区域或细胞经染色后棕黄色显色的有无、数量、种类及深浅来判定，判定标准为：①没有出现棕黄色区域或细胞的判为阴性；②组织中棕黄色区域或细胞零星分布且少于5％的判为弱阳性；③组织中棕黄色区域或细胞分布比例为5％～50％为阳性；④组织中棕黄色区域或细胞在组织中分布比例大于50％为强阳性。