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一种环脂肽表面活性剂的生物合成方法，其特征在于，其具体步骤如下所示：(1)以外加氯化铵的海水为培养基，进行葡萄球菌WX2701低温厌氧发酵，按10％(v/v)的接种量，将葡萄球菌WX2701的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)接入发酵培养基；采用SKY‑200B型全温摇床，于10℃和150rpm的条件下培养48h；(2)对获得的发酵液进行无菌过滤，并依次向获得的滤液中加入无色杆菌WX1501和长链脂肪烃(C<sub>20‑40</sub>)单体或混合物进行发酵；按10％(v/v)的接种量，依次将无色杆菌WX1501的摇瓶种子液(浓度约1010个/ml)，长链脂肪烃(C<sub>20‑40</sub>)单体或混合物(总浓度100mg/ml)接入发酵培养基；采用SKY‑2102C型恒温摇床，于28℃和150rpm的条件下培养4d；(3)从发酵液中分离得到具有高表面活性的环脂肽表面活性；用6M的NaOH将发酵液的pH值调至8.0。于10000rpm下离心分离20min，收集上清液(Xia et al.，2011)；采用截留分子量为10000Da的膜对水相溶液进行过滤，进一步除去杂质，收集透过液；用等体积的乙酸乙酯对去除菌体、杂质的发酵液再萃取2次，合并萃取液；将其放入旋转蒸发仪中，于50℃下蒸发去除溶剂，即得粗提物；采用湿法装填层析柱的方式，将200‑300目硅胶与氯仿混合，装填入玻璃层析柱(Ф2.5×400mm)，使硅胶装填率达80％左右；待硅胶沉降后，按2ml/min的流速加入100ml氯仿对柱子进行平衡处理，封闭层析柱，静置过夜，备用；用少量甲醇溶解粗提物，与少量200‑300目硅胶混合，拌匀，将其置于50℃下烘干；将硅胶与少量氯仿混合，加入层析柱，即可完成进样；依次采用氯仿、氯仿/乙酸乙酯(9:1,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(8:2,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(7:3,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(6:4,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(5:5,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(4:6，v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(3:7,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(2:8,v/v)的混和液、氯仿/乙酸乙酯(1:9,v/v)的混和液、乙酸乙酯作为流动相进行洗脱，每种流动相的洗脱体积为300ml，洗脱流速为0.5ml/min；从氯仿/乙酸乙酯(9:1,v/v)的流动相开始收集洗脱液，每20ml收集1管，用紫外分光光度计在200‑280nm的范围内扫描吸收波长，将波形相近的样品合并；真空蒸发去除溶剂，可得初步纯化的样品；用甲醇溶解初步纯化的样品；采用反相液相色谱制备生物表面活性剂的纯品(Das et al.,2009)；液相色谱制备的条件为：Waters 600 HPLC，色谱柱为Xterra Prep RP18 OBD，以甲醇/水(1:1，v/v)的混合物为流动相，流速为0.5μL/min，检测器波长为256nm。 |
