过氧化氢消除核酸恒温扩增检测汞离子时DTT干扰的方法

摘要

过氧化氢消除核酸恒温扩增检测汞离子时DTT干扰的方法，将含有错配位点并具有引发核酸恒温扩增的引物和模板的识别序列按浓度100nM等体积混合，识别序列结合待测的含汞溶液中汞离子之后可形成可被聚合酶识别的稳定杂交结构；将稳定杂交结构与过氧化氢溶液、扩增底物、DNA聚合酶KF、SYBR GreenⅠ、以及扩增反应缓冲液混合反应，在聚合酶作用下引发扩增反应，产生双链DNA；SYBR GreenⅠ能够特异性结合在双链DNA分子上，同时发出荧光信号；利用溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳对扩增后序列进行表征，证实过氧化氢消除了DTT干扰，本发明消除DTT对痕量汞离子检测的干扰，具有良好的体系兼容性，同时操作简便，不依赖于复杂设备。

主权项

过氧化氢消除核酸恒温扩增检测汞离子时DTT干扰的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将含有错配位点并具有引发核酸恒温扩增的引物和模板的识别序列按浓度100nM等体积混合，识别序列结合待测的含汞溶液中汞离子之后可形成可被聚合酶识别的稳定杂交结构；(2)将结合汞离子之后的稳定杂交结构与过氧化氢溶液、扩增底物、DNA聚合酶KF、SYBR GreenⅠ、以及扩增反应缓冲液混合反应，反应温度为37℃，时间为15min；混合物中各个组分浓度分别为：引物浓度100nM、模板浓度100nM、过氧化氢浓度0.01％‑0.5％、扩增底物40μM、DNA聚合酶KF 0.5U、SYBR GreenⅠ浓度为2×SYBR GreenⅠ，扩增反应缓冲液为10mM Tris,75mM KAc,10mM Mg(Ac)₂,pH＝7.9；引物和模板形成稳定杂交结构后暴露3’末端，在聚合酶作用下引发扩增反应，产生双链DNA；SYBR GreenⅠ能够特异性结合在双链DNA分子上，同时发出荧光信号；(3)利用溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳对扩增后序列进行表征，证实过氧化氢消除了DTT干扰，制作溶解曲线所用条件为：用实时荧光PCR在60‑95℃范围内扫描荧光信号；琼脂糖凝胶电泳表征条件为：2％琼脂糖凝胶浓度，60V电压下，电泳30min。