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一种海甘蓝种间杂种基因组原位杂交的方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)探针标记体系的建立及封阻DNA制备1)探针的标记体系利用CTAB法提取母本海甘蓝(Crambe kralikii)叶片的基因组DNA，采用切口平移法用Bio‑11‑dUTP对提取的母本海甘蓝基因组DNA进行标记，所述的标记体系为：<img file="FDA0001071224610000011.GIF" wi="1558" he="678" />在200μl的离心管中依次加入上述各组分，充分混匀并离心，然后将其置于15℃中水浴2.5h；标记结束后用1％的琼脂糖凝胶检测片段大小，如片段大小为200‑500bp时，加入浓度为0.5M的5μl EDTA，终止反应，置于‑20℃保存备用；2)封阻DNA制备：利用CTAB法提取父本海甘蓝(Crambe abyssinica)叶片基因组DNA用作封阻DNA，处理方式为将该基因组DNA在沸水中处理40min，使其DNA片段的长度与探针长度同为200－500bp；(2)原位杂交制片1)载玻片的准备将新的玻片放入80％浓硫酸配制的铬酸溶液中，室温下放置10h以上，捞出后用自来水洗掉铬酸，仔细清洗每张玻片；然后将清洗好的片子放置于流水中冲洗至少10min，再用蒸馏水冲洗一次，用100％乙醇浸泡备用；2)酶解花药将固定好的海甘蓝花药放入柠檬酸缓冲液中，置摇床上摇动20min，放入酶的混合液中，所述酶的成分和浓度为0.6％纤维素酶，0.2％的果胶酶和0.1％的蜗牛酶；于37℃下水浴45‑52min；3)制片将酶解好的海甘蓝花药用吸管轻轻移入柠檬酸缓冲液中漂洗20min，用吸管将所述的花药材料移到预先晾干的载玻片上，并加一滴柠檬酸缓冲液，在解剖境下仔细解剖海甘蓝的花药，去掉杂质，在滴液干之前加5‑10μl的45％乙酸；放置1min后，用移液器滴加一至数滴的冷的卡诺固定液展片，待卡诺固定液干后在相差显微镜下检查制片的质量；选择质量好的制片于‑20℃下保存备用；(3)原位杂交将准备原位杂交的制片在37℃的烘箱中烘至12h；1)蛋白酶的处理准备一个能够同时放置几张玻片的塑料盒子，底部放一张滤纸，用20×SSC润湿，置于37℃烘箱中预热，每片加浓度为8μg/mL的蛋白酶K150μl，盖上耐高温的塑料软膜，将载玻片平稳的置于湿盒内，盖上盖子后于37℃烘箱中温育30min；2)RNA酶处理将载玻片从湿盒中拿出，放入盛有70ml的2×SSC的玻片缸中，待软膜飘起后将其捞出，将玻片缸置于平板摇床上轻摇5min；每片加浓度为150μl的RNA酶液100μg/ml，使用前用2×SSC稀释，盖膜，在湿盒中37℃温育1h；3)多聚甲醛的处理在RNA酶处理的同时，配制4％的多聚甲醛溶液，加入14ml的0.1M的NaOH溶液，摇动三角瓶直到溶液变澄清，补充蒸馏水至70ml，摇匀冷却后倒入玻片缸中，置通风橱中备用；将经过RNA酶处理好的制片放入玻片缸中用2×SSC在摇床上漂洗三次，每次4min；放入多聚甲醛溶液中，摇床上摇动15min；再用2×SSC漂洗三次；制片分别在70％、100％的乙醇中脱水5min；空气中干燥；4)杂交混合液的制备在1.5ml的离心管中按每张制片的量依次加入以下试剂或组分：<img file="FDA0001071224610000021.GIF" wi="1430" he="671" />将杂交混合液混匀，离心，70℃水浴变性10min，冰上冷却5min，每片加50μl杂交混合液，盖膜，在原位PCR仪上80℃下共变性处理5min，于37℃湿盒中温育过夜；5)杂交后的洗脱a)用0.1×SSC配制20％的甲酰胺溶液，42℃水浴预热，同时预热两份2×SSC溶液；b)将玻片放入盛有2×SSC的玻片缸中，待塑料膜飘起后捞出；c)将玻片转入上述预热的浓度为20％的甲酰胺中，42℃水浴10min；d)将玻片转入预热的2×SSC中两次，每次5min；e)在室温下，用2×SSC漂洗玻片一次，5min；6)生物素检测a)用1×磷酸盐缓冲液即PBS将玻片漂洗一次，5min；b)5％的牛血清白蛋白(BSA)100μl/每片，室温放置5min,揭膜；c)用％牛血清白蛋白与荧光素Cy3按1：40的体积比配制Cy3溶液，然后每一玻片上加50ul上述配制好的Cy3溶液，最后盖膜；d)在湿盒中37℃温育30min；e)用1×PBS洗三次，每次5min；7)DAPI负染与封片a)向每一玻片上滴加浓度为5μg/ml的DAPI 100μl；b)将玻片盖膜后在室温下放置15min；c)将玻片放入1×PBS中待膜飘起后拿出；d)每一玻片加抗荧光猝灭剂一滴；e)将上步的玻片在4℃下避光保存；(4)对杂交信号进行检测。 |
