玛咖杂交种的无性快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种玛咖杂交种的无性快速繁殖方法，将消毒处理后的玛咖杂交种外植体接入愈伤组织诱导培养基中，待愈伤组织发生后转入丛苗发生和增殖培养基中培养，待丛苗发生并增殖到一定数量时，在增殖培养基中继代增殖，增殖苗数量达到生根要求时，将丛苗中生长健壮的主苗转接至生根培养基中培养，苗壮根粗时按常规进行炼苗3 d后，移栽至装有消毒腐殖质的漂浮盘中培养60 d，得到生长健壮的玛咖杂交种无性种苗。本发明对玛咖杂交种无性种苗生产工艺进行了优化调整，在获得愈伤组织及丛芽后，增殖培养采用高NH₄⁺的MS和低NH₄⁺的B₅为基本培养基交替使用，彻底解决了玛咖试管苗易老化、黄苗现象，缩短无性繁殖周期，提高了繁殖效率，为玛咖杂交种F₁代优质种苗繁育提供了有效途径。

主权项

一种玛咖杂交种的无性快速繁殖方法，其特征在于，所述繁殖方法包括以下步骤：（1）玛咖杂交种外植体的选择、处理选择生长健壮的杂交种植株的幼嫩花序作为玛咖杂交种外植体，用自来水清洗所述幼嫩花序表面的不洁物后，放入烧杯中，用细纱布扎紧烧杯口，于自来水下流水冲洗2 h，置于超净工作台上，用灼烧过的镊子将幼嫩花序从烧杯内逐一取出，投入到体积比为75％的酒精中消毒15 s，再用质量比为0.1％的 HgCl₂灭菌5 min，最后用无菌水冲洗6‑8次，去除幼嫩花序上残留的升汞，之后放在无菌滤纸上吸干表面水分，得到消毒灭菌处理的外植体；（2）接种、培养Ⅰ、以B₅为基本培养基，附加玉米素1.0～2.0 mg/L、萘乙酸0.01～0.1 mg/L、蔗糖 20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得愈伤组织诱导培养基A；将所述步骤（1）选取的消毒灭菌玛咖杂交种外植体接种于所述愈伤组织诱导培养基A中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，进行愈伤组织诱导；Ⅱ、以B₅为基本培养基，附加6‑苄氨基嘌呤1.0～2.0 mg/L、萘乙酸1.5～2.0 mg/L、玉米素0.1～1.0 mg/L、蔗糖20000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整 pH值为5.4～5.8，制得丛苗发生及增殖培养基B；所述步骤Ⅰ愈伤组织诱导培养基A中的愈伤组织培养25～35 d待其增殖膨大至直径2～3cm后，将其切割为0.2～0.3cm²，转接至所述丛苗发生及增殖培养基B中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养5 d后愈伤组织生长明显，7 d后分化出大量芽点，30 d后生长为小而致密的簇状丛苗；Ⅲ、以MS为基本培养基，附加6‑苄氨基嘌呤1.0～2.0 mg/L、萘乙酸1.5～2.0 mg/L、玉米素0.1～1.0 mg/L、蔗糖30000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得增殖培养基C；将所述步骤Ⅱ所得的簇状丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述增殖培养基C中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12 h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养15 d，得既有主苗又有较小丛苗的簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗进行转接，较小丛苗可继续增殖培养；Ⅳ、所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B与所述步骤Ⅲ增殖培养基C轮流使用进行继代培养，即所述步骤Ⅲ得到的簇状转接丛苗中的较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述丛苗发生及增殖培养基B中，依照所述步骤Ⅱ的条件培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗接种于生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗切割成3～5苗一丛转接入所述步骤Ⅲ增殖培养基C中培养15 d后，得簇状转接丛苗，主苗作为生根转接苗接种于生根培养基D中进行生根培养，较小丛苗再次切割成3～5苗一丛转接入所述步骤Ⅱ丛苗发生及增殖培养基B中继续增殖培养，如此循环进行，每一代培养15 d后均可得正常、健壮的簇状转接丛苗，之后继续进行所述步骤Ⅴ、VI的工艺；Ⅴ、以1/2MS为基本培养基，附加萘乙酸0.1～0.5 mg/L，吲哚丁酸0.1～0.5 mg/L、活性炭0.5～1.5 mg/L、蔗糖15000 mg/L和琼脂粉4800 mg/L，调整pH值为5.4～5.8，制得生根培养基D；选取所述步骤Ⅲ或步骤Ⅳ所得簇状转接丛苗中高3～4 cm、生长健壮的主苗接种于所述生根培养基D中，在光照度1500～2000 lx、光照时间10～12h/d、温度控制在20±1℃的条件下，培养25 d后得苗壮根粗的生根苗；VI、取所述步骤Ⅴ所得6～8 cm高的生根苗置于室温下炼苗3 d后，打开瓶盖从培养基中取出幼苗，将所述幼苗上残留培养基清洗干净，放入质量浓度为0.1～0.2%的多菌灵溶液中消毒2～3 min后，移栽至装有经消毒的腐殖质的漂浮盘中，保持18～25℃的温度漂浮培养60 d后，得移栽苗。