一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法

摘要

本发明涉及一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，包括：培养液的制备、检测材料的准备、超高效液相色谱‑串联质谱检测、酶活性的分析四个步骤。在培养液中加入¹⁵N标记的茶氨酸合成底物(¹⁵N标记的盐酸乙胺)，通过超高效液相色谱‑串联质谱检测反应产物中合成的茶氨酸含量，运用其中¹⁴N‑茶氨酸与¹⁵N‑茶氨酸的比例，来区分培养过程中合成的茶氨酸，以分析茶氨酸合成酶活性。本发明针对性强，方法简单，准确性强，灵敏度高，能够准确检测到茶氨酸合成酶反应产物；操作方便，检测方法精确，避免了以前茶氨酸合成酶检测过程中，其提取的粗酶液中含有的高含量茶氨酸本底，在酶活性较低，产物较少的情况下无法检测到酶活性。

主权项

一种快速检测茶氨酸合成酶活性的检测方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)培养液的制备(1‑1)培养液的制备按照体积比为4:1的比例将30mmol/L KH₂PO₄溶液和30mmol/L K₂HPO₄溶液混合，调节混合溶液pH至5.6，得到K‑Pi缓冲液，备用；配制200mmol/L的蔗糖溶液，备用；将K‑Pi缓冲液和200mmol/L的蔗糖溶液按体积比19:1的比例混匀后灭菌，冷却后取4ml加入40mg抗坏血酸钠盐，得到溶液A；(1‑2)稳定性同位素培养液的制备在(1‑1)步中制备的溶液A中加入300mmol/L ¹⁵N标记的盐酸乙胺；(2)检测材料的准备(2‑1)植物材料的处理取茶树组织，用70％酒精快速消毒，蒸馏水洗净，滤纸吸干，称重后切成约2mm×2mm的块状，在无菌操作台中，将已切成块状的茶树组织加入培养液中，28℃在摇床中培养12h，转速160rpm；(2‑2)培养后材料的处理终止培养，取出培养液中的茶树材料，用蒸馏水冲洗吸干，加入液氮，快速研磨成粉末状，转移至离心管中，在‑20℃下冷冻4h，再在冷冻干燥机中冷冻至足干，并留取其培养液待测；(2‑3)材料中茶氨酸的提取取冻干后的粉末，转移至10ml离心管中，加入3ml沸水，100℃水浴20min后离心分离15min取上清液，重复两次，定容至10ml；将提取液和留取的培养液通过水相滤头过滤待测；(3)材料中茶氨酸的超高效液相色谱–串联质谱分析(3‑1)标准曲线的制备利用茶氨酸标品配制浓度分别为0.5mg/mL，0.25mg/mL，0.1mg/mL，0.01mg/mL，0.001mg/mL，0.0001mg/mL，0.000001mg/mL的茶氨酸标准样品，将上述不同浓度的茶氨酸标准样品进行LC‑MS/MS分析，以茶氨酸浓度为横坐标，以茶氨酸离子相对吸收峰值为纵坐标，求得标准曲线；(3‑2)将培养12h后的茶树组织提取液和培养液进行LC‑MS/MS分析，根据标准曲线计算培养12h后的茶树组织提取液和培养液中总茶氨酸的含量，¹⁴N‑茶氨酸的含量，¹⁵N‑茶氨酸的含量，计算茶氨酸合成酶活力。