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一种磷酸化HOXA10作为子宫内膜容受性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)细胞培养将人子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEK293T细胞维持培养于含10％FBS和青链霉素双抗的DMEM/F12培养液中，待细胞长至90％汇集时，用质量体积比为0.25％胰酶细胞消化液常规消化传代，在37℃、5％CO<sub>2</sub>、饱和湿度中培养；(2)免疫印记实验步骤(1)得到的Ishikawa或HEK293T细胞经预冷的PBS漂洗后，加入细胞裂解缓冲液，刮取收集细胞，4℃旋转裂解30min；12000g离心30min后收集上清；经Bradford法测定蛋白质浓度后，取总蛋白进行10％SDS‑PAGE胶电泳分离，并按常规方法转印至PVDF膜上，加入以下相应抗体：anti‑Myc‑HRP,anti‑Flag‑HRP,anti‑MST1,Phospho‑MST1(Thr183),anti‑phosphothreonine,anti‑phosphoserine,anti‑HOXA10,anti‑β‑actin,anti‑GAPDH，进行相关蛋白表达与磷酸化修饰检测；(3)免疫共沉淀HEK293T细胞长至80％汇集后，采用脂质体FuGENE 6将Myc‑HOXA10和/或Flag‑MST1cDNA转入HEK293T细胞，48小时后收集细胞总蛋白，分别与c‑Myc Beads和/或Flag M2Beads4℃缓慢摇动孵育过夜，Beads经预冷的RIPA buffer洗3次，每次5分钟后，离心收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃加热5分钟，离心，取上清进行10％SDS‑PAGE电泳，蛋白经转移至硝酸纤维素膜上后按Western blotting常规操作进行分析蛋白间相互作用情况；Ishikawa细胞总蛋白经ProteinA/G agarose 4℃缓慢旋转孵育2h，5000g、4℃离心1min后收集上清，分别加入HOXA10抗体与Rabbit IgG，4℃缓慢旋转孵育4h后，再加入ProteinA/G，在4℃缓慢旋转孵育过夜，次日5000g、4℃离心1min收集Beads，加入SDS上样缓冲液，95℃金属浴加热5分钟，冰上静置5min，离心后取上清进行10％SDS‑PAGE胶电泳分离，按照常规方法转印到PVDF膜上，加入Anti‑MST1抗体进行MST1蛋白检测，以明确Ishikawa细胞中MST1与HOXA10相互结合情况；(4)重组His‑HOXA10融合蛋白制备以pCMV‑Flag‑HOXA10质粒为模板，采用<img file="FDA0000676767760000021.GIF" wi="290" he="64" />Pfx DNA聚合酶分别扩增HOXA10不同结构域片段(HOXA101‑318、HOXA10318‑410及HOXA10318‑410T376A)，分别克隆至原核表达载体pET‑28a(+)，经酶切，测序获得阳性克隆后，转化入BL21感受态细胞，分别挑取4个克隆于37℃恒温摇床中250rpm扩增12～14h，次日取过夜菌液加入液态琼脂糖培养基，37℃恒温摇床中250rpm扩增3h后，加入终浓度为1mM IPTG，30℃，250rpm诱导蛋白表达，融合蛋白经10％SDS‑PAGE胶电泳分离，考马斯亮蓝染色及免疫印迹分析正确表达后，选取上清表达的克隆进行大量表达重组His‑HOXA10融合蛋白，并经His‑Mag Agarose Beads纯化富集后，洗脱蛋白定量后，分装‑80℃保存备用；(5)体外磷酸化实验重组His‑HOXA10融合蛋白与具激酶活性的重组MST1和[γ‑32P]混匀于kinase assay buffer,30℃孵育0‑120分钟，加入Laemmli样品缓冲液，混匀，95℃加热5分钟终止反应；离心，取上清进行10％SDS‑PAGE，干胶，放射自显影，观察目的蛋白的磷酸化状况；或加入非放射性标记的ATP，采用相应抗体anti‑phosphothreonine,anti‑phosphoserine和anti‑pHOXA10抗体进行Western Blot检测HOXA10蛋白磷酸化修饰情况；(6)人绒毛膜癌细胞(BeWo)细胞球黏附实验利用人绒毛膜癌BeWo细胞系建立体外细胞球培养体系作为体外胚胎粘附于内膜细胞单层上的模型。 |
