一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法

摘要

本发明公开了一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，使用草莓茎尖生长点来做草莓转基因，可直接从田间取材操作，操作过程简单，没有材料的时间限制，不受外界环境影响，随时可以取样；茎尖生长点具有很强的脱分化和再分化的能力，生长点通过长成愈伤组织，再分化芽的过程来长成完整植株，由于生长点的分化能力极强，因此，愈伤组织生长和分化芽的过程都会极大地缩短，一般比叶片叶柄或者茎段分化芽的过程时间都要缩短一半，解决草莓转化效率低的问题，缩短转基因周期，减小转基因工作量和工作强度；此外，生长点分化芽的能力非常强，通常情况下分化芽的能力在100%，即使经过菌液侵染以后，分化能力也能够达到50%以上，这是明显高于叶片、叶柄等其他外植体的。

主权项

一种使用草莓茎尖生长点的转基因方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在田间取3~5cm长度的草莓茎尖，洗干净茎尖表面，用75%的酒精消毒30秒，无菌水冲洗3次后，用质量分数0.1%的升汞溶液清洗茎尖表面8分钟后用无菌水冲洗茎尖6~8次，冲洗完成后剥去茎尖外边的包叶，在解剖镜下将大小为0.2mm的茎尖生长点切下，倒入茎尖预培养液体培养基S1中的滤纸上，预培养1~2小时；（2）预培养结束以后，将培养基S1中的滤纸取出，放置于茎尖愈伤组织分化培养基S2中，培养5天，生长点周围开始有部分愈伤组织生长；（3）将活化好的菌液倒入无菌培养皿中，从S2培养基中取出滤纸，直接放置于菌液侵染中，侵染10分钟，过程中每隔2分钟轻轻摇动培养皿，增加菌液和生长点的的接触面积，侵染完成后将滤纸拿出放置于茎尖愈伤组织共培养培养基S3上共培养3天；（4）共培养结束以后，将滤纸上的茎尖生长点小心用镊子取出，均匀放置于茎尖愈伤组织筛选培养培养基S4上，生长25天后生长点会由愈伤组织长出，此时再将生长点转移至茎尖愈伤组织筛选培养培养基S5上， 20天可长出芽，芽长出后在体式荧光显微镜下进行观察，可以明显看出一部分芽有非常亮的绿光发出，这部分芽为抗性愈伤，保留，而一部分没有发光，这部分芽为非抗性芽，去除，通过这个步骤，将非抗性的愈伤去除，保留下的抗性愈伤经过约40 天的培养以后，分化出抗性植株，此时再进行一次荧光检测，在体式荧光显微镜下进行观察抗性植株，整个抗性植株叶片和叶柄都发绿光的保留下来，发红光的去除掉；（5）生根培养：抗性植株长到大约2~3厘米高时，将抗性植株转入草莓生根筛选培养基S6上生根，获得完整的抗性苗，再进行一次荧光检测，荧光检测中抗性苗的叶片、叶柄以及根都发亮绿光的确定为转基因植株。