一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法及应用

摘要

本申请公开了一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法，本发明通过提供下述方法：构建含MDA5C末端(447‑1025aa)以及N端带有Myc标签的质粒pCMV‑myc‑MDA5C，瞬时转染HEK293细胞，炎症性肌病患者的待测血清与过表达MDA5C末端的HEK293细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用c‑myc抗体检测沉淀的MDA5C末端，解决了目前国内还没有商业化的检测MDA5抗体的ELISA试剂盒以及免疫印迹膜条的问题，以及自行包被MDA5抗原的ELISA试剂盒的高成本、高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性等问题。

主权项

一种检测炎症性肌病特异性自身抗体MDA5的非放射标记免疫沉淀方法，其特征在于，包括以下步骤：1)利用引物MDA5‑F和MDA5‑R从pENTER‑MDA5质粒中扩增人MDA5的C末端；2)回收纯化PCR片段克隆至pCMV‑myc载体，构建含MDA5C末端以及N端带有Myc标签的质粒pCMV‑myc‑MDA5C，酶切鉴定确定pCMV‑myc‑MDA5C的插入子；3)测序证实MDA5C末端序列和读码框的准确性；4)将pCMV‑myc‑MDA5C质粒瞬时转染HEK293细胞48小时，采用western Blot以及c‑myc抗体或MDA5抗体确定MDA5C末端在HEK293细胞中的过表达；5)采用20ul MDA5抗体阳性的炎症性肌病患者血清或健康对照血清与200ug过表达MDA5C端的细胞裂解液进行免疫沉淀，然后进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用c‑myc抗体进行检测。