一种酶标记仿生免疫分析检测敌百虫和乙酰甲胺磷的方法

摘要

本发明涉及一种酶标记仿生免疫分析检测敌百虫和乙酰甲胺磷的方法，包括半抗原的合成、酶标抗原的制备、多识别位点亲水性分子印迹聚合物膜的制备以及标准曲线的建立等步骤。本发明是以制备的亲水性印迹聚合物膜作为仿生抗体代替生物抗体，利用免疫吸附测定原理，建立对敌百虫或乙酰甲胺磷具有广泛检测范围的高灵敏检测方法。克服了传统生物抗体制备周期长、易失活、成本高等缺点，可大大缩短了分析时间。本发明成本低廉，实验操作简单，灵敏度高，适用于各种农产品中敌百虫或乙酰甲胺磷的快速检测。

主权项

一种酶标记仿生免疫分析检测敌百虫或乙酰甲胺磷方法，其特征在于包括以下步骤：1)有机磷农药通用半抗原的合成：冰浴条件下将0.005‑0.02mol 4‑氨基丁酸溶于5‑10mL 2.5mol/L氢氧化钠溶液中，完全溶解后向上述溶液中滴加1.215mL O，O'‑二甲基硫代磷酰氯，室温下磁力搅拌器搅拌6h；洗涤去除杂质，并用浓度为1.0mol/L盐酸调节反应溶液pH值至2.0；10‑20mL乙酸乙酯萃取三次后向有机相加入无水硫酸钠过夜干燥，旋蒸得有机磷农药通用半抗原4‑(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸；2)酶标抗原的制备：将步骤1)制备的有机磷农药通用半抗原4‑(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸0.03‑0.05mmol溶于600‑800μL二甲基亚砜中，然后加入3.4mg N‑羟基琥珀酰亚胺和12.4mg N,N'‑二环己基碳酰亚胺，室温搅拌反应2‑4h，离心取上清液，得到溶液A；将5‑10mg辣根过氧化物酶溶解于1‑2mL浓度50mmol/L K₂HPO₄溶液中作为溶液B；冰浴条件下，将50‑200μL溶液A缓慢逐滴加入溶液B中，边滴加边摇动；4℃反应8‑12h，取出后用磷酸盐缓冲溶液PBS透析1‑3天，收集透析液得到酶标抗原标准溶液，4℃保存备用；5倍PBS溶液组分为：由Na₂HPO₄·12H₂O：68.80g、NaH₂PO₄·2H₂O：8.97g和NaCl：45.00g，加双蒸水定容至1L组成；将5倍PBS用双蒸水稀释5倍即为PBS溶液；3)多识别位点水相分子印迹膜的制备：4‑8mL超纯水、3‑6mL二甲基亚砜和8‑15mL乙腈的混合溶剂体系中分别加入摩尔比1:3:4‑6所述的有机磷农药通用半抗原4‑(二甲氧基硫代磷酰胺基)丁酸、甲基丙烯酸和二甲基丙烯酸乙二醇酯，然后加入10‑20mg偶氮二异丁腈，搅拌反应0.5‑2h；96孔酶标板上每孔加入200μL搅拌反应后的混合液，氮气保护条件下20‑60℃聚合反应12‑24h，用体积比3‑9:1甲醇/冰乙酸溶液超声洗脱4‑10h后用浓度100％甲醇溶液洗脱2‑4h，干燥后得多识别位点水相印迹聚合物膜；4)多残留酶标记仿生免疫分析方法的建立：步骤3)制备的水相印迹聚合物膜作为仿生抗体；步骤2)制备的酶标抗原标准溶液用PBS溶液稀释5000倍，作为酶标稀释液；将96孔酶标板第1行设为空白组，每孔只加200μL PBS溶液；第2行设为对照组，每孔加100μL酶标稀释液和100μLPBS溶液；第3‑8行每孔依次分别加入敌百虫或乙酰甲胺磷标样梯度稀释液和100μL酶标稀释液；室温孵育1h后用磷酸盐吐温缓冲液PBST洗板五次；96孔酶标板每孔加入100‑200μL底物液，室温下反应30‑60min；每孔加入50‑100μL 1.25mol/L硫酸，终止反应；用酶标仪读取96孔酶标板第1‑8行吸光度值A，分别计算抑制率；以敌百虫或乙酰甲胺磷标样梯度稀释液浓度的对数值为横坐标，相应的抑制率百分数为纵坐标，分别绘制标准曲线；PBST溶液的组分为：5倍PBS 200mL，10％的Tween‑20：5mL，加双蒸水定容至1L；所述底物液的配制为：底物A：8.2g无水醋酸钠、2.5gβ‑环糊精和150mg过氧化氢脲，加双蒸水定容至1000mL，调pH至5.0，4℃保存；底物B：50mg3,3,5,5‑四甲基联苯胺溶于5mL二甲基亚砜，室温避光保存；使用前15min，取14.6mL底物A和0.45mL底物B混合成底物液；5)称取1‑2g待测样品，粉碎后加入5‑10mL PBS溶液超声提取3次，过滤得样品提取液；将样品提取液代替步骤4)中所述敌百虫或乙酰甲胺磷标样梯度稀释液，重复步骤4)操作，根据抑制率由标准曲线计算出待测物中敌百虫或乙酰甲胺磷的含量。