基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法

摘要

本发明公开一种基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法。本发明采用非酶扩增及杂交链式反应体系，针对检测目标microRNA序列设计特异性的DNA发卡探针H1、H2、H3、H4序列；当扩增体系中含有待测microRNA，由H1+H2双链复合结构触发后续的杂交链式反应过程，杂交链式反应过程由H3和H4共同完成；经链霉亲和素磁珠捕捉，将扩增产物捕捉，并由电化学检测系统产生并检测电化学发光信号。该方法全过程不需要酶的参与，原理简单且检测成本低；具有恒温扩增、高灵敏度、操作简单、易于普及等优点。该方法适用于核酸检测，也可以结合蛋白适配体相关技术用于蛋白检测。

主权项

一种基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计用于非酶扩增体系的发卡探针根据非酶扩增原理及microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针H2序列；发卡探针H1的5′端和3′段都标记有6碳氨基；H2的3′端标记生物素；其中，H1包含桥序列；(2)设计用于杂交链式反应体系的发卡探针在非酶扩增体系的基础上，并结合杂交链式反应原理，设计了用于杂交链式反应体系的发卡探针H3、以及发卡探针H4的序列；其中，发卡探针H3及H4的5′端和3′段都标记有6碳氨基；发卡探针H1、H2、H3及H4能相互共存，并不发生扩增；(3)电化学发光基团标记电化学发光基团标记主要包括以下步骤：a、取2.5OD发卡探针H1、H3、H4，离心5min，使粘在管壁的DNA落入管底，分别加入75μL 0.1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min；b、离心，并加入30μL 11.2mM的电化学发光基团，充分混匀后避光孵育12小时；然后，加入1mL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时；c、离心，倒去浅黄色溶液，向DNA沉淀中加入1mL预冷体积分数80％乙醇水溶液洗涤，放入超低温冰箱1h；d、离心，倒去溶液，收集沉淀，加入1mL预冷体积分数80％乙醇水溶液洗涤，放入超低温冰箱中1h；e、离心，倒去溶液，收集沉淀，加20μL水稀释，分别获得H1、H3、H4探针溶液，放‑20℃保存；(4)发卡探针预处理为了使发卡探针H1、H2、H3、H4充分形成发卡结构，向H2及步骤(3)中得到的H1、H3、H4探针溶液中分别加入磷酸盐缓冲液，并将PBS终浓度设置为1×；随后，加热至95℃之后，使其充分变性；最后，梯度降温，每分钟降5℃、降至常温为止，分别得到发卡探针H1、H2、H3、H4的预处理产物，产物保存于4℃或‑20℃环境中备用；(5)基于指数信号增强非酶扩增检测体系构建取一定量步骤(4)中得到的发卡探针H1、H2、H3、H4的预处理产物，使其终浓度皆为50nM，并加入PBS缓冲液，使其终浓度为1×，再加入RNA酶抑制剂，使其终浓度为1U/μL，最后加DEPC水至100μL；充分混匀后，加入待测microRNA，37℃温浴2小时；(6)产物清洗及分离向步骤(5)中加入链霉亲和素磁珠，37℃温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶液后，再加入100μL的PBS缓冲液，使其终浓度为1×，溶解磁珠，再进行磁分离，并清洗，由此反复清洗三次；(7)信号检测将步骤(6)中的产物，放入电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据；所述的发卡探针的序列根据待测microRNA的序列改变而做相应改变；步骤(5)中所述的待测microRNA为microRNA21，其序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；步骤(1)中所述的桥序列为CCTAATGGTGTGGC；所述的发卡探针H1的序列为TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTCCTAATGGTGTGGC；其5′端和3′段都标记有6碳氨基；所述的发卡探针H2的序列为ATAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA；其3′端标记生物素；所述的发卡探针H3的序列为CCTAATGGTGTGGCCCATGTTTTGCCACACCATTAGGAGTCTG；其5′端和3′段都标记有6碳氨基；所述的发卡探针H4的序列为ACATGGGCCACACCATTAGGTTTCAGACTCCTAATGGTGTGGC；其5′端和3′段都标记有6碳氨基。