表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用

摘要

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。所述生物芯片是通过在固相载体固定蝇毒磷‑卵清蛋白耦联物作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，芯片活化后在生物芯片上固定探针得到的；该生物芯片的应用包括利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过抑制法检测蝇毒磷的应用。直接检测法可进行抗体的筛选，研究免疫反应动力学；竞争抑制法可检测蝇毒磷小分子的浓度，检测限低于25μg/L。该生物芯片具有快速、实时、能现场检测的特点，灵敏度高而成本低，不污染环境。

主权项

一种表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用；所述表面等离子体共振生物芯片的制备方法包含如下步骤：(1)在玻璃基底上沉积厚度为45～55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；(2)在培养皿中注入含有HS(CH₂)₁₀COOH和HS(CH₂)₆OH的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；(3)将步骤(2)得到的固相载体固定在SPR检测仪上；(4)流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N‑羟基琥珀酰亚胺和N‑乙基‑N’‑(二甲氨基丙基)碳二亚胺的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；(5)在生物芯片表面固定蝇毒磷‑卵清蛋白偶联物，记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；(6)加入乙醇胺溶液封闭灭活剩余的酯键；然后通入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片；其中，步骤(2)中所述的HS(CH₂)₁₀COOH的终浓度为0.1mM，所述的HS(CH₂)₆OH的终浓度为0.9mM；步骤(4)中所述的N‑羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L，所述的N‑乙基‑N’‑(二甲氨基丙基)碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；步骤(5)中所述的蝇毒磷‑卵清蛋白偶联物的浓度为83mg/L；所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测蝇毒磷单克隆抗体的应用，包含如下步骤：(一)建立标准曲线：已知浓度的蝇毒磷单克隆抗体用PBS缓冲液配置成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；(二)未知样品的检测：将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤(一)得到的回归标准曲线，计算出未知样品中蝇毒磷单克隆抗体的浓度；(三)下一样品检测：步骤(二)中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS‑HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原‑抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品；其中，步骤(一)中所述的蝇毒磷单克隆抗体的标准溶液的浓度范围为0.01mg/L～100mg/L；步骤(一)所述的标准溶液的检测量为100μL，所述的免疫反应的反应时间为5～6min，所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；步骤(二)中所述的未知样品的检测量为100μL，所述的免疫反应的反应时间为5～6min，所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；步骤(三)中所述的SDS‑HCl溶液中SDS的质量分数为1％，HCl的浓度为0.01mol/L。