一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法及其应用

摘要

一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法及其应用。环境检测过程中因烷烃羟化酶基因alkB编码的基因多样性较高，难以一次准确定量。本方法首先用通用序列接头的特异引物对目的基因进行预扩增，使目的基因的预扩增产物带有这段通用序列；然后用通用序列作引物实现预扩增产物的定量分析。本方法成功解决了普通多重实时荧光定量PCR技术中由引物扩增效率差异、非特异性扩增、引物二聚体等引起的定量结果准确性和可比性差的问题，可通过一步PCR反应准确地对PCR体系中多个目的基因的总量进行一次性定量。本方法操作简便快速，特异性高，检测结果准确可靠，检测灵敏度高，最低检测浓度为1×10²拷贝/ml。

主权项

一种一次准确定量烷烃羟化酶基因alkB的方法，其特征在于采用如下步骤进行：(1)选用两条引物序列UP‑1 5′‑TAGGGGTGACTACCCACGGGT‑3′，UP‑25′‑TGATAGGGAAGGCCCTGACGG‑3′作为多重引物实时荧光定量PCR中特异引物前的通用序列；(2)选用15组针对alkB基因第二个和第四个组氨酸保守区对应的核酸序列设计引物，其中上游混合引物由M‑1F至M‑15F等比例混合而成：M‑1F：5'‑TAGGGGTGACTACCCACGGGTCACTTCTACATCGAGCACAAYC‑3’M‑2F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACACTTCTACATCGAGCACAAYC‑3’M‑3F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAACTTCTTCATCGAGCACAACC‑3’M‑4F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGACCTTCTACGGGCACTTCT‑3’M‑5F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGTACGGTCACTTCTTTATTGAGC‑3’M‑6F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGATATGGTCATTTCTTCATTGAG‑3’M‑7F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATACAGGTTACAACCATTTCCG‑3’M‑8F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATCGTTCCTACAGGATACAATCAC‑3’M‑9F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACTTCATCGAGCACAACAAAG‑3’M‑10F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATCCACTTCTACGTCGARCACA‑3’M‑11F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACACTTCTACATCGAGCACAAYC‑3’M‑12F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATACTTCTACGTGGAGCACAAC‑3’M‑13F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATTCTTCAYCGAGCACAACCG‑3’M‑14F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACACTTCTACATCGAGCACAAYC‑3’M‑15F：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGGACACTTCTTTGTGGAACACA‑3’；下游混合引物由下列引物M‑1R至M‑15R以等比例混合而成：M‑1R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAAGGTGGTACAGGAAGATGTTG‑3’M‑2R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAATGTGGTCGGAGTTCCAG‑3’M‑3R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAAGCAGGTGGTACAGGAAGATGT‑3’M‑4R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGGTGACAATCCGATTACTGTT‑3’M‑5R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAAAGGTGGAACAGCACTAGATTAG‑3’M‑6R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGATTGATAGGACCTTGTAGGATG‑3’M‑7R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGGATAAGCATGATGATCTGAGTG‑3’M‑8R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACGTGATGATCTGAATGTCGTT‑3’M‑9R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAGGTGATCGGAGTGCCTCT‑3’M‑10R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATGCGTGGTGGTCRCTGTG‑3’M‑11R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATGCAGGTGGTASAGGAGC‑3’M‑12R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATCGTGGTGGTCGCTGTGY‑3’M‑13R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTAAGTGGTGGACGGAGTGSC‑3’M‑14R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTATGATTCGCGTGATGGTCACT‑3’M‑15R：5'‑TAGGGGCTATGAGGGACGCTACAACTGCTACAGGAASAGGTT‑3’；(3)环境样品的采集和预处理；(4)环境样品中微生物宏基因组DNA的提取；(5)阳性和阴性DNA对照样品的制备；(6)烷烃羟化酶基因alkB标准曲线的绘制及灵敏度实验；将浓度为10⁷copies/μL的阳性DNA对照样品，依次稀释为1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹和1.0×10⁰，每个梯度设置3个平行，并且设置无模板对照，利用上述步骤(2)的引物体系为模板进行预扩增，预扩增的PCR体系为：2×FSU SYBR Green I MIX溶液25μL，2.5mmol/μL的dNTP混合液5μL，20pmol/μL的上、下游混合引物各2μL，DNA对照样品1μL，添加无菌去离子水至总体积50μL；预扩增条件为：95℃5分钟；然后依次94℃30秒、52℃30秒、72℃50秒3‑8个循环；72℃10分钟；利用预扩增产物进行实时荧光定量PCR分析；实时荧光定量的PCR体系为：预扩增的PCR体系50μL，20pmol/μL的通用序列引物UP‑1和UP‑2各2μL；扩增条件为：95℃5分钟；然后依次94℃30秒、66℃30秒、72℃50秒35个循环；72℃10分钟；扩增反应结束后，计算各浓度DNA对照样品所对应的Ct值，并以拷贝数的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标绘制烷烃羟化酶基因alkB标准曲线；(7)用步骤(2)的15对5’端含有通用序列接头的特异引物对环境样品中微生物基因组DNA的烷烃羟化酶基因alkB进行预扩增，进一步利用预扩增产物进行实时荧光定量PCR分析；预扩增的PCR体系为：2×FSU SYBR Green I MIX溶液25μL，2.5mmol/μL的dNTP混合液5μL，20pmol/μL的上、下游混合引物各2μL，环境样品的微生物宏基因组DNA1μL，添加无菌去离子水至总体积50μL；预扩增条件为：95℃5分钟；然后依次94℃30秒、52℃30秒、72℃50秒3‑8个循环；72℃10分钟；利用预扩增产物进行实时荧光定量PCR分析；实时荧光定量的PCR体系为：预扩增的PCR体系50μL，20pmol/μL的通用序列引物UP‑1和UP‑2各2μL；扩增条件为：95℃5分钟；然后依次94℃30秒、66℃30秒、72℃50秒35个循环；72℃10分钟；(8)扩增反应结束后，根据待测环境样品中微生物宏基因组DNA扩增的Ct值及标准曲线的拟合方程式计算出烷烃羟化酶基因alkB的量。