一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用

摘要

本发明公开了一种耐高温重组β‑甘露聚糖酶及其应用。将来自黑曲霉的按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的β‑甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母KM71H中，可得到高表达量的重组β‑甘露聚糖酶。该重组β‑甘露聚糖酶最适温度为80℃。将本发明的β‑甘露聚糖酶用于酶解魔芋精粉生产甘露低聚糖，底物浓度高，产物产量高，反应时间短，转化率高，具有较大的工业化生产潜力和应用价值。

主权项

一种耐高温重组β‑甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用；底物浓度为100‑200g/L的高浓度生物质，酶用量为10‑50IU/g，酶初始阶段一次性加入，底物分多次添加，添加时间间隔在1‑3h，pH 4.0‑6.0、50‑90℃的震荡或搅拌条件下共酶解4‑12h后冷却后离心去残渣，上清即为甘露低聚糖；所述的生物质为魔芋粉、田菁胶、刺槐豆胶和瓜尔胶的一种或多种；其中，所述的耐高温重组β‑甘露聚糖酶按如下步骤制备得到：A构建重组菌株：(1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZαA–man，该质粒以AOX1为启动子，并含有SEQ ID No：1所示的β‑甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因；所述的重组质粒pPICZαA–man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZαA中形成的重组质粒；(2)将重组密码子优化质粒pPICZαA–man用Sac I酶切线性化后，将密码子优化质粒pPICZαA–man导入大肠杆菌进行扩增，再电击转化入毕赤酵母宿主菌KM71H中，即构成表达β‑甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株；(3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达β‑甘露聚糖酶的重组工程菌；B将步骤A构建的重组菌在BMGY培养基中30℃培养至细胞密度OD_600nm＝2～6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD_600nm为1.0以诱导表达，28℃继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为1％v/v，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，经超滤和分子筛纯化制备得到耐高温重组β‑甘露聚糖酶。