一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法

摘要

一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，涉及一种毛果杨不定芽诱导及植株再生的方法。本发明是要解决现有毛果杨组织培养器官发生困难、植株再生率低以及目前用毛果杨茎段做外植体不定芽诱导率低和周期长的问题。方法：一、材料的采集及处理；二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段经无菌处理后接种培养，繁殖无菌苗；三、不定芽分化诱导；四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基中培养；五、不定芽生根培养；六、炼苗和移栽。本发明以毛果杨无菌苗叶片做外植体，不定芽诱导率和成活率高达100％，从外植体培养至成苗仅用60天左右时间。用于植物组织培养领域。

主权项

一种毛果杨叶片不定芽诱导及植株再生的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、材料的采集及处理：选择温室内培养的生长健壮、无病虫害的毛果杨植株，采集新萌生的枝条，剪去枝条上的叶片，将剩余枝条剪成长度为9～11cm且带有3～4个芽点的茎段，用自来水冲洗1～2h；二、接种培养及无菌苗的扩繁：将自来水冲洗过的茎段经无菌处理后，接种到生根培养基WPM3中培养，繁殖无菌苗；三、不定芽分化诱导：以步骤二培养得到的毛果杨无菌苗叶片做外植体，选取生长健壮的毛果杨无菌苗叶片，剪掉叶尖，仅保留长为0.8～1.1cm的叶基部分及0.2～0.3mm的叶柄，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基WPM1中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m^‑2·s^‑1的条件下培养，15～20d即可诱导出不定芽；所述不定芽诱导培养基WPM1由400mg/L KNO₃、370mg/L MgSO₄、96mg/L CaCl₂、8.6mg/L ZnSO₄、0.25mg/L CuSO₄、27.8mg/L FeSO₄、990mg/L K₂SO₄、170mg/L KH₂PO₄、22.4mg/L MnSO₄、6.2mg/L H₃BO₃、0.25mg/L NaMoO₂·2H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6‑苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8；四、不定芽伸长诱导：将带有不定芽的愈伤组织切成块放入不定芽伸长培养基WPM2中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m^‑2·s^‑1的条件下培养15d；所述不定芽伸长培养基WPM2由400mg/L KNO₃、370mg/L MgSO₄、96mg/L CaCl₂、8.6mg/LZnSO₄、0.25mg/L CuSO₄、27.8mg/L FeSO₄、990mg/L K₂SO₄、170mg/L KH₂PO₄、22.4mg/LMnSO₄、6.2mg/L H₃BO₃、0.25mg/L NaMoO₂·2H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、2.0mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L 6‑苄基腺嘌呤、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸、0.0001～0.01mg/L噻苯隆和蒸馏水制成，pH值为5.8；五、不定芽生根培养：将茎长超过1.5cm的不定芽从基部剪下，分割成单株接种于生根培养基WPM3中，在温度为23～25℃，每日光照12～16h，光照强度30～40μmol·m^‑2·s^‑1的条件下培养7～10d生根；所述生根培养基WPM3由400mg/L KNO₃、990mg/L K₂SO₄、370mg/LMgSO₄、96mg/L CaCl₂、8.6mg/L ZnSO₄、0.25mg/L CuSO₄、27.8mg/L FeSO₄、170mg/L KH₂PO₄、22.4mg/L MnSO₄、6.2mg/L H₃BO₃、0.25mg/L NaMoO₂·2H₂O、37.3mg/L Na₂EDTA、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆辛、0.5mg/L烟酸、100mg/L肌醇、2.0mg/L甘氨酸、25mg/L蔗糖、5.6mg/L琼脂、0.01～1.0mg/L吲哚丁酸和蒸馏水制成，pH值为5.8；六、炼苗和移栽：将根长超过2cm的植株经炼苗2～3d后移栽到温室培养。