发明名称 |
一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法 |
摘要 |
本发明公开一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法。该方法针对食品添加剂日落黄、胭脂红的化合结构及其对细胞毒性作用的实验结果,筛选表征日落黄、胭脂红联合细胞毒性的特异性指标:细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH,通过高内涵分析系统对六个指标检测分析,根据特异性指标的分析结果鉴定其联合毒性。本发明方法对检测过程进行了优化,具有快速、可靠、重复性好、特异性强等优点,可以为食品添加剂日落黄、胭脂红的正确使用提供理论依据,对保证食品添加剂的正确使用和食品安全具有重要意义。 |
申请公布号 |
CN105907836A |
申请公布日期 |
2016.08.31 |
申请号 |
CN201610243853.7 |
申请日期 |
2016.04.11 |
申请人 |
浙江工商大学 |
发明人 |
曲道峰;韩剑众;董雨婷 |
分类号 |
C12Q1/02(2006.01)I |
主分类号 |
C12Q1/02(2006.01)I |
代理机构 |
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代理人 |
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主权项 |
一种快速检测食品添加剂(日落黄、胭脂红)联合毒性方法,其特征在于该方法包括以下步骤:步骤(1).在预铺细胞粘附剂的96孔板上,SMMC‑7721细胞以5×10<sup>4</sup>个/孔/100μL种板,37℃,5% CO<sub>2</sub>培养12h;步骤(2).取出步骤(1)携有培养后SMMC‑7721细胞的96孔板,弃掉培养液,然后加入160μL/孔RPMI‑1640培养基、40μL/孔5×待测样品,培养时间为72h;同时设立加入40μL/孔的细胞培养液作阴性对照;所述的待测样品为日落黄、胭脂红混合液,最终浓度依照食品包装袋上的剂量添加;步骤(3).取出步骤(2)培养后的96孔板,加50μL/孔的活细胞染料溶液,37℃孵育30min;所述的活细胞染料溶液为Hoechst 34580,Mitotracker orange,lysoTracker Deep Red三种染料的混合液,三者的最终浓度比值为1∶2∶1;步骤(4).弃掉培养液,加100μL/孔预温至37℃的固定液,常温避光放置20min;步骤(5).在步骤(4)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤1次,再加入100μL/孔的透膜缓冲液,常温避光孵育10min;步骤(6).在步骤(5)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤2次后,加入1000倍体积FITC标记的细胞微管蛋白抗体,常温避光孵育1h;步骤(7).在步骤(6)处理后的96孔板中加入100μL/孔的PBS进行洗涤2次后,加入200μL/孔的PBS,然后使用ImageXpress Micro成像高内涵图像分析系统检测,检测条件如下:第一通道选择“DAPI”检测Hoechst34580标记的细胞核,第二通道选择“FITC”检测FITC标记的细胞微管蛋白,第三通道选择“Cy3”检测Mitotracker orange标记的线粒体膜电位(活细胞),第四通道选择“Fura‑2”检测lysoSensor Blue标记的溶酶体PH值;普通光源下检测细胞总数;选择20倍物镜,每孔采集10个视野的图像,存储信息用于图像分析;步骤(8).采用MetaXpress分析软件对步骤(7)检测到的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH进行定位和定量分析,并以细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH参数形式表示,根据MetaXpress分析软件分析的细胞总数、活细胞数量、细胞核状态、细胞微管蛋白、线粒体膜电位、溶酶体PH六个参数判定食品添加剂日落黄、胭脂红的联合毒性。 |
地址 |
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