一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法

摘要

本发明公开了一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，包括龙眼肉蛋白多糖的制备、龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品制备、龙眼肉蛋白多糖的检测。异硫氰酸荧光素能特异结合龙眼肉蛋白多糖分子中的结合蛋白，保障了定量检测的可行性和检测目标的专一性，采用高效分子排阻色谱结合荧光检测器分析检测龙眼肉蛋白多糖，在1～200μg/mL的浓度范围内线性关系良好，能实现龙眼蛋白多糖的定量分析，最低检出限为0.25μg/mL，最低定量限为0.85μg/mL；同时结合峰响应的保留时间，能有效表征蛋白多糖的分子量分布，达到对目标物质的定性分析。本发明不仅能同时实现蛋白多糖的定性、定量检测，而且方法检出限低、灵敏度高、专一性强。

主权项

一种龙眼肉蛋白多糖的检测方法，其特征在于，所述的龙眼肉蛋白多糖的检测方法包括：步骤一、取龙眼干果肉，加蒸馏水进行匀浆处理，龙眼肉匀浆保温浸提后，抽滤分离滤液；滤液浓缩后，转入截留分子量为3500的透析袋中，置于蒸馏水中低温透析；透析袋内溶液真空浓缩后冷冻干燥，得到龙眼粗蛋白多糖粉末；步骤二、取龙眼粗蛋白多糖溶于蒸馏水中，充分溶解后离心后取上清液加入Sephadex G‑100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，测定洗脱液在280nm处的吸光值以表征其蛋白含量，收集合并同时出现多糖和蛋白信号的洗脱液，冷冻干燥得到龙眼肉蛋白多糖的纯品；步骤三、取龙眼粗蛋白多糖溶于碳酸钠缓冲液中，加入异硫氰酸荧光素，于室温下避光搅拌反应，反应结束后，离心取上清液加入Sephadex G‑100凝胶柱中，并以蒸馏水洗脱，采用苯酚硫酸法测定洗脱液中的多糖含量，并分别测定洗脱液在280nm和489.5nm处的吸光值以表征其蛋白和荧光素含量，收集合并同时出现多糖、蛋白和荧光素信号的洗脱液，冷冻干燥得到荧光标记龙眼肉蛋白多糖的纯品；步骤四、采用硝酸钠溶液配制系列浓度的荧光标记龙眼肉蛋白多糖样液，分别经0.45μm微孔滤膜过滤后采用液相色谱仪结合荧光检测器分析，进行荧光标记龙眼肉蛋白多糖的标准曲线测定，其中液相色谱仪为高效液相色谱仪，色谱柱为：Ultrahydrogel 1000凝胶色谱柱，7.8mm×300mm，Waters；色谱分析条件为：流动相，0.10mol/L硝酸钠；流速，0.5mL/min；柱温，35℃；荧光检测器，λ_ex490nm，λ_em518nm；进样量，25μL；步骤五、以蛋白多糖浓度与峰面积对数对建立标准曲线进行定量分析，以响应峰的保留时间进行分子量的定性分析。