一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法

摘要

本发明公开一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上,10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；b:重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。采用本发明技术方案，免除了异源细胞和异源蛋白对诱导多能干细胞的影响，同时转录效率高，不影响诱导多能干细胞的分化能力，且培养代数多，维持寿命长，在临床上具有巨大潜力。

主权项

一种建立和培养人诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.制备人成纤维样细胞饲养层：取人成纤维样细胞，接种至培养皿上用10毫克/毫升丝裂霉素C提前处理3个小时，去除丝裂霉素C；所述步骤a中人成纤维样细胞采用如下方法生成：a1：使用人包皮成纤维细胞重编程得到人诱导多能干细胞5.9细胞系；a2：在基质胶上维持培养5.9细胞系7天；a3：使用1毫克/毫升分散酶于37℃环境下消化5‑7分钟后进行传代培养，培养液为培养液每天更换；a4：当培养于基质胶中的5.9细胞系达到80％满时，去除培养基后用1×PBS清洗两次，然后直接添加人成纤维样细胞培养基使5.9细胞系开始定向分化，前四天每天更换培养基，之后每2天更换一次；a5：诱导6～12天后将长满的细胞用0.05％胰蛋白酶‑EDTA消化，并以1×10⁶个/孔的浓度把细胞接种在基质胶预处理的6孔板上；当细胞再次长满时，将细胞消化并以2×10⁵个/孔的浓度接种到0.1％明胶预处理的6孔板中；a6：在明胶处理过的平板上培养3‑5天后细胞形态逐渐均一，即为人成纤维细胞样；b.培养：重编程体细胞，生成人诱导多能干细胞，并将人诱导多能干细胞移植于步骤a中制备的饲养层中培养。