一种呼吸道合胞病毒样颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及呼吸道合胞病毒样颗粒，建立了一种新的制备呼吸道合胞病毒样颗粒的方法，并用于动物免疫。本发明按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F、G基因进行密码子优化，分别克隆到穿梭载体中，获得重组腺病毒质粒，转染，获得重组腺病毒FGAd‑Msyn，FGAd‑Fsyn、FGAd‑Gsyn；将重组腺病毒感染Vero细胞，获得病毒样颗粒；采用蔗糖密度梯度离心的方法进行病毒样颗粒纯化；并用于动物免疫。本发明采用腺病毒载体制备病毒样颗粒，建立了一种新的病毒样颗粒制备方法，并通过密码子优化，提高蛋白表达量，提高病毒样颗粒的产量，获得较好的免疫效果，并且相对安全。

主权项

一种呼吸道合胞病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，利用重组腺病毒制备呼吸道合胞病毒样颗粒，其步骤包括：(1)按照哺乳动物细胞密码子偏性，对M、F和G基因进行密码子优化，分别命名Msyn、Fsyn、Gsyn；(2)将Msyn、Fsyn、Gsyn分别克隆到穿梭载体中，得到重组穿梭质粒，将重组穿梭质粒转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy‑1的RecA⁺E.coli BJ5183/p的感受态细胞，筛选鉴定，获得重组腺病毒质粒pAdeasy‑Msyn，pAdeasy‑Fsyn，pAdeasy‑Gsyn；(3)将pAdeasy‑Msyn，pAdeasy‑Fsyn，pAdeasy‑Gsyn分别转染293细胞，获得重组腺病毒FGAd‑Msyn，FGAd‑Fsyn、FGAd‑Gsyn；(4)将FGAd‑Msyn单独感染Vero细胞，或者将FGAd‑Msyn与FGAd‑Fsyn和/或FGAd‑Gsyn感染Vero细胞，获得含有病毒样颗粒的上清液；(5)蔗糖密度梯度离心进行纯化，获得纯化后的病毒样颗粒；其中，所述密码子优化的M基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；其中，所述密码子优化的F基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示，密码子优化的G基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示；其中步骤(5)中蔗糖密度梯度离心的步骤为：(1)将上清液离心；(2)弃掉上清，将沉淀重悬，分别加入60％、50％、30％蔗糖垫层，离心；(3)收集目的条带位置的蛋白带，再分别加入60％、50％、40％、30％、20％蔗糖垫层，离心；(4)收集密度接近的样品，加入预冷的NTE混匀，离心；(5)弃掉上清，用预冷的NTE重悬沉淀，分装；其中NTE组成如下：25mM Tris‑HCl,pH 7.4，150mM NaCl，0.1M MgSO₄，0.01M EDTA。