GC-MS研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理及检测方法

摘要

本发明公开了一种基于气相色谱‑质谱联用(GC‑MS)研究灰葡萄孢菌代谢组的样品前处理方法和代谢组检测方法。本发明提供的对灰葡萄孢菌样品前处理方法如下：在铺有玻璃纸的PDA平板上培养灰葡萄孢菌，培养2～4d(优选3d)后收集菌丝，液氮灭活后超低温冰箱保存备用。冷冻研磨破碎菌丝样品，代谢组提取采用冷冻过的甲醇水混合物以使酶失活。离心干燥后，经过肟化(或腙化)和硅烷化两步衍生化反应后用于GC‑MS检测。本发明还提供了利用GC‑MS对上述样品进行的检测方法，检测条件如下：选用HP‑5MS毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；进样量1μL；程序升温；离子源温度230℃，全扫描范围m/z20～650。采用本发明的提取及检测方法能得到重现性较好的代谢组检测结果。

主权项

灰葡萄孢菌代谢组样品前处理方法，包括以下方法并依次进行：菌丝的培养、收集、灭活、保存、代谢组的提取、干燥和衍生化；所述培养方法为：将灰葡萄孢菌的菌丝组织于PDA固体培养基上17～23℃培养，将培养2～4d的灰葡萄孢菌落按同心圆外缘打取菌饼，接至铺有玻璃纸的PDA平板上，17～23℃培养2～4d，得菌丝培养物；所述收集方法具有以下特征：用刮刀刮取玻璃纸上的菌丝培养物，去除接种的菌柄，收集至离心管中；所述灭活处理为：将装有菌丝的离心管置于液氮中速冻3～5min；所述保存方法为：将按上述方法培养、收集、灭活的菌丝样品用封口膜密封后，置于超低温冰箱保存；所述提取方法包括以下步骤：1)冷冻研磨破碎：灭活后的菌丝在液氮条件下研磨，或采用球磨仪研磨破碎处理，得菌丝粉末；2)代谢组提取：称取100.0±0.5mg的菌丝粉末，准确加入4mL溶解5μg/mL内标物质的提取溶剂，采用涡旋振荡1min后，继续超声提取20min；3)离心处理：将2)提取获得的代谢组溶液在4000～12000rpm下进行离心5～15min，弃去沉淀，得代谢组提取液；所述的干燥方法为抽真空离心干燥；所述的衍生化方法包括肟化或腙化以及三甲基硅烷化两步衍生化反应，步骤如下：1)吸取100μL衍生化试剂1加入已离心干燥好的样品管中，封口，超声15min，涡旋1min溶解，稍微离心后30℃条件下肟化或腙化衍生化反应2h；2)加入100μL的衍生化试剂2至样品管中，封口，超声20min，稍微离心，37℃条件下硅烷化衍生反应4～10h；3)衍生化获得的样品在转速10000～15000r/min下离心15min，吸取上清液至GC样品玻璃管中，获得用于GC‑MS检测的灰葡萄孢菌菌丝代谢组样品；所述提取溶剂为：甲醇与水混合溶液，甲醇与水混合体积比为9.5∶0.5～5∶5；所述的内标物质为：水杨苷(D(‑)‑Salicin)；所述衍生化试剂1为：甲氧基胺盐酸盐溶解于吡啶获得的溶液，浓度为10～40mg/mL；所述的衍生化试剂2为：三甲基氯硅烷、N，O‑双三甲硅基乙酰胺、三甲基咪唑、N，O‑双三甲硅基三氟乙酰胺、N‑甲基‑N‑三甲硅基三氟乙酰胺、六甲基二硅胺烷、N‑甲基‑N‑三甲硅基乙酰胺中的任意一种。