樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法

摘要

樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，它涉及樟子松成熟胚体细胞胚胎诱导方法。本发明要解决利用未成熟合子胚诱导体胚发生受季节时间限制的问题。本发明方法：一、外植体消毒接种；二、胚性愈伤组织的诱导；三、胚性愈伤组织的增殖与保持；四、体胚的成熟诱导。本发明外植体取材方便，污染率控制在5％以内，樟子松胚性愈伤组织的诱导率高，愈伤组织增殖培养可以增殖3‑4倍，并在添加脱落酸的培养基中成功的诱导了樟子松的体细胞胚胎。本发明采用的成熟合子胚外植体与已获得成功的樟子松未成熟合子胚作为外植体诱导体胚技术相比，成熟合子胚的体胚发生技术具有保存期长、材料丰富且不受季节、植物发育时期等因素限制。

主权项

樟子松成熟合子胚体细胞胚胎的诱导方法，其特征在于它包括以下步骤：一、外植体消毒接种：取当年收获冷藏保存的成熟樟子松种子，流水冲洗干净，再用40～50℃的温水浸泡2h后用质量百分含量为70％的酒精表面消毒0.5～1min，无菌水冲洗3～5次，置于质量百分含量为0.1％的升汞溶液中消毒5min后，用无菌水冲洗5～6次，于超净工作台中剥去胚乳；二、胚性愈伤组织的诱导：将步骤一处理后的合子胚采用DCR培养基进行胚性愈伤组织的诱导，其中，DCR培养基含浓度为2mg/L的2,4‑D、浓度为1mg/L的6‑BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；三、愈伤组织的增殖与保持：将步骤二诱导培养15d获得的胚性愈伤组织置于DCR培养基中进行愈伤组织的保持和增殖，DCR培养基含浓度为1mg/L的2,4‑D、浓度为0.5mg/L的6‑BA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白和浓度为1000mg/L的肌醇、质量百分含量为3％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；四、体细胞胚成熟的诱导：将步骤三增殖的胚性愈伤组织置于DCR培养基中进行体胚成熟的诱导，即完成；其中，DCR培养基含浓度为1～2mg/L的ABA、浓度为500mg/L的酸水解酪蛋白、质量百分含量为5％的蔗糖和质量百分含量为0.7％的琼脂，培养基的pH值为5.7～5.8；其中，步骤一中樟子松成熟种子为当年9月采收于4℃保存1年内健康饱满均匀的成熟樟子松种子。