一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法

摘要

本发明涉及一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，该方法利用全细胞固定化或分泌海藻糖合酶基因工程菌连续高效生产海藻糖并连续色谱分离、纯化、结晶制备海藻糖。本发明首次建立了一套连续性强的产酶及制备海藻糖生产工艺，该工艺以全细胞表面展示或胞外分泌的海藻糖合酶或麦芽寡糖基海藻糖合成酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶进行转化，避免了细胞的破碎和分离纯化成本，酶液或固定化酶方便获取，操作简便。

主权项

一种连续胞外酶生物法制备海藻糖的方法，包括如下步骤：(1)将胞外分泌或表面展示的以麦芽糖或可溶性淀粉为底物的产海藻糖合酶或麦芽寡糖基海藻糖合酶‑麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶的菌株进行活化培养，然后经扩大培养，制得菌体浓度为50～80g/L的菌液；(2)将步骤(1)制得的菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，诱导酶的胞外分泌表达或芽孢表面展示或全细胞表面展示，然后过滤，制得全细胞表面展示菌体、表面展示芽孢或粗酶液，将粗酶液经膜浓缩后，制得浓缩酶液；(3)将步骤(2)制得的浓缩酶液、全细胞表面展示菌体或表面展示芽孢与浓度为250～350g/L的麦芽糖溶液进行反应，在温度为15～55℃，pH7.5～8.5的条件下，反应24h～36h，反应液经过滤，制得糖液；或者，将步骤(2)制得的浓缩酶液、全细胞表面展示菌体或表面展示芽孢与浓度为150～250g/L的可溶性淀粉进行反应，在温度为15～55℃，pH5.0～6.0的条件下，反应24h～36h，反应液经过滤，制得糖液；(4)将步骤(3)制得的糖液升温至75～80℃，灭酶活0.4～0.6h，经硅藻土过滤，维持温度70～75℃进行活性炭脱色，然后降温至40～50℃，再次过滤后，进行离子交换，制得除盐糖液；(5)将步骤(4)制得的除盐糖液浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，进行一次色谱分离，去除多糖和葡萄糖，然后浓缩至糖浓度为50％～55％(质量百分比)，经二次色谱分离，制得海藻糖液和麦芽糖液，麦芽糖液回收再利用，海藻糖液经浓缩结晶，制得海藻糖。