一种赤水金钗石斛原生质体分离、纯化方法及专用试剂

摘要

一种赤水金钗石斛原生质体分离、纯化方法及专用试剂。包括试剂A和试剂B。试剂A由MES、KCl、Mannitol、Cellulase R10、Pectolyase Y‑23、BSA、CaCl₂和ddH₂O组成，试剂B（10ml）由MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl₂、ddH₂O按比组成。用该试剂制备原生质体：1）在摇床上用溶液A黑暗处理金钗石斛叶片碎片4 h左右即可释放出叶片中的原生质体；2）将1）获得的原生质体溶液过200目的细胞筛过滤，收集滤液离心3 min，用溶液B溶解沉淀物，反复离心纯化原生质体；3）用FDA对所纯化的原生质体进行活力检测。

主权项

一种赤水金钗石斛原生质体分离与纯化方法，其特征在于：1）、原生质体的分离：取金钗石斛无菌再生苗或野生植株，选取大而饱满的叶片，在超净工作台中将其横向切割为1mm 的片段，放入小培养皿中，将溶液A 倒入培养皿里，用镊子将所取材料在溶液A 中反复浸蘸多次，使材料与溶液A 充分接触，使酶解效果更充分，溶液A 的使用量为溶液A 刚好淹没叶片小段，然后用封口胶封口，置于恒温摇床上振荡，26‑28℃、60rpm、黑暗处理4h ；当原生质体从材料上充分分离下来后，即终止酶解，用吸头轻轻吹打叶片，以释放出全部原生质体；10ml 的溶液A 成分及含量为：0.8 mmol/ml 的Mannitol加入量为5.0ml，0.2 mmol/ml 的MES 加入量为1.0ml，0.08 mmol/ml的KCl 加入量为2.5ml，0.25 mmol/ml 的CaCl₂加入量为400.0μl，10 mg/ml 的BSA 加入量为1.0ml，ddH₂O 加入量为100.0μl，Cellulase R10 的加入量为100.0mg，Pectolyase Y‑23 的加入量为40.0mg；2）、原生质体的纯化：将酶解4h 的原生质体混合液用200 目的细胞筛过滤，再将滤液置于2ml 离心管中，在100g/min 下离心3min，使原生质体沉降，然后弃上清液，将沉降物缓慢加入溶液B 中，在100 g/min 的转速下离心3‑5 次，每次3min，最终得到纯化的原生质体；10ml 的溶液B 成分及含量为：0.8 mmol/ml 的Mannitol 加入量为5.0ml，0.2 mmol/ml 的MES 的加入量为1.0ml，0.08mmol/ml 的KCl 加入量为2.5ml，0.25 mmol/ml 的CaCl₂加入量为400.0μl，10 mg/ml 的BSA加入量为1.0ml，ddH₂O 的加入量为100.0μl；3）、原生质体产量的测定：将纯化后的原生质体转入2ml 溶液B 中，轻轻吹打，使原生质体分布均匀，用移液枪吸取一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，取平均值；根据加入溶液A 中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片获得的原生质体细胞数表示；4）、原生质体活力的鉴定：利用FDA 即荧光素双醋酸酯透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力；计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。