一种牛皮明胶的定量检测方法

摘要

一种牛皮明胶的定量检测方法，它是联合胞内蛋白酶Lys‑C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用HPLC‑LTQ Orbitrap MS鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H₂¹⁸O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测¹⁸O标记前后的特征峰峰面积，准确计算牛皮明胶添加量。本发明的有益效果：1、联合胞内蛋白酶Lys‑C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，可有效增强酶解效果，提高牛皮明胶特征峰的检出率；2、LTQ Orbitrap MS具有非常高的分辨率，可保证定量检测的误差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化¹⁸O标记和HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测，能准确定量检测食品中的牛皮明胶添加量，可为相关部门监控食品提供依据。

主权项

一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：A、牛皮明胶酶解（1）加入碳酸氢铵溶液配制牛皮明胶溶液；（2）加入胞内蛋白酶 Lys‑C，使牛皮明胶酶解；（3）再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解；B、同位素标记（1）加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys‑C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；（2）冻干;（3）进一步去除水分；（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H₂¹⁶O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H₂¹⁸O，进行标记；C、HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测（1）将标记物和未标记物混合；（2）上样检测：将混合样品注射进入HPLC‑LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解物中H₂¹⁶O标记的特征峰和H₂¹⁸O标记的特征峰，上样量为0.5‑20μg；D、数据分析（1）根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰；（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰面积；（3）定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即¹⁸O/¹⁶O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，¹⁸O/¹⁶O按照如下公式计算：其中，I₀, I₂ 和 I₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；M₀, M₂ 和 M₄分别代表未标记即¹⁶O的特征肽在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。