一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法

摘要

本发明公开了一种克隆橡胶树乳管特异性强启动子PHEV2.1，与天然橡胶生物合成途径的关键限速酶HbHMGR1基因连接构建植物表达载体，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，获得转基因植株的方法。本发明从橡胶树优良品种材料中克隆PHEV2.1和HbHMGR1基因，构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301‑PHEV2.1‑HbHMGR1，转化橡胶树易碎胚性愈伤组织，得到了橡胶树转基因胚状体和转基因植株，用GUS染色、PCR和反向PCR证明得到了转基因植株，用荧光定量PCR技术检测证明HbHMGR1基因在橡胶树转基因胚状体和转基因植株中表达量显著提高，为用基因工程方法提高橡胶产量奠定了基础。

主权项

一种用乳管特异性启动子获得橡胶树转基因植株的方法，其特征在于包括天然橡胶生物合成关键限速酶基因HbHMGR1克隆，橡胶树乳管特异性强启动子PHEV2.1的克隆，构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301‑PHEV2.1‑HbHMGR1，橡胶树易碎胚性愈伤组织的培养，橡胶树继代易碎胚性愈伤组织遗传转化，获得胚状体和再生植株，组织化学检测和分子检测，转基因胚状体、转基因植株和对照材料的荧光定量PCR检测；所述的橡胶树乳管特异性启动子PHEV2.1的克隆是根据HEV2.1基因序列(NCBI登录号：AY247789.1)，截取起始密码子前的1830bp碱基序列，用Primer5.0设计一对特异性引物PHF1和PHR1，上游引物为PHF1：5’‑CCCAAGCTTCTTGTTTGCACATGATGCGTTCAGGTGACC‑3’，下游引物为PHR1：5’‑TTCCAATGCATTGGCTGCAGAACTCTTCCCATTTCTTCCC‑3’，下划线部分为在引物两端引入的酶切位点HindIII和PstI酶切位点；提取橡胶树优良品种叶片基因组DNA为模板，以PHF1和PHR1为引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收、加尾“A”后，克隆到pMD19‑T vecor上，转化大肠杆菌Trans5α，经12～16h的培养后，挑取单菌落进行菌液PCR，选取PCR检测为阳性的菌落送往测序公司进行测序；测序结果用NCBI网上的BLASTN工具进行序列同源性分析；所述的构建HbHMGR1基因的乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301‑PHEV2.1‑HbHMGR1是先利用XbaI和XmaⅠ分别对pCAMBIA3301和pCAMBIA2301‑HbHMGR1进行双酶切，酶切产物经1.0％的琼脂糖凝胶电泳后，分别切胶回收pCAMBIA3301的大片段和pCAMBIA2301‑HbHMGR1的小片段(HbHMGR1基因)，将两片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌Trans5α，过夜培养后挑取单菌落进行菌落PCR检测，提取阳性重组质粒pCAMBIA3301‑HbHMGR1；再用HindIII和PstI分别对pCAMBIA3301‑HbHMGR1和pMD19‑T‑PHEV2.1进行双酶切，电泳结束后，分别对pCAMBIA3301‑HbHMGR1的大片段和pMD19‑T‑PHEV2.1的小片段(PHEV2.1)进行切胶回收，回收产物用T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌，过夜培养后挑取单菌落进行菌液PCR，提取阳性重组质粒，并用HindⅢ、PstⅠ和XmaⅠ对其进行酶切鉴定，确认得到的阳性重组质粒为pCAMBIA3301‑PHEV2.1‑HbHMGR1；最后用HindⅢ和XmaⅠ将PHEV2.1‑HbHMGR1重组片段从pCAMBIA3301‑PHEV2.1‑HbHMGR1上切下，将其连接到pCAMBIA2301‑MCS的HindⅢ和XmaⅠ间，得到植物表达载体pCAMBIA2301‑PHEV2.1‑HbHMGR1，转化大肠杆菌，挑取单菌落进行菌落PCR，提取阳性重组质粒，用HindⅢ和XmaⅠ进行酶切鉴定，确认HbHMGR1乳管特异性植物表达载体构建成功。