一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法

摘要

本发明公开了一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，包括制作粘孢子虫悬浮液、制作蛋白甘油粘性玻片、烘片、染色、脱色洗片以及脱水封片步骤。本发明的方法整个流程制作一般不超过2小时，如果使用染色架和染缸进行，还可以实现批量制作。染色效果好，在40倍物镜下，粘孢子虫孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，这样极囊、孢质和壳片界线分明，孢子的形态结构一目了然；100倍油镜下，极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝清晰可见，制好的玻片可以重复观察使用，且能常年保存。

主权项

一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，其特征在于包括如下步骤：(1)粘孢子虫悬浮液制作：从保存于福尔马林中的患粘孢子虫病病鱼上取出孢囊放入适量蒸馏水中，弄破孢囊使得粘孢子虫分散悬浮于蒸馏水中，粘孢子虫悬浮液中的孢子虫的浓度为0.01～1×10⁶/ml；(2)甘油蛋白粘性玻片制作：用大头针取芝麻大小的甘油蛋白均匀涂在载玻片上，用滴管滴2～3滴粘孢子虫悬浮液于甘油蛋白粘性玻片上，摇晃玻片使粘孢子虫悬浮液均匀地分布于玻片上；(3)烘片：把带有粘孢子虫的玻片在38～42℃干燥箱里烘干，以玻片上液体刚蒸发完为止；或者自然条件下晾干；(4)染色：用滴管吸取瑞氏‑姬姆萨A液0.5～0.8ml覆盖于带有粘孢子虫的烘干玻片上,染色5～8min；再将瑞氏‑姬姆萨B液滴加于瑞氏‑姬姆萨A液上，滴加量是瑞氏‑姬姆萨A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微风使得液面产生涟漪状而充分混合，染色8～10min；用蒸馏水缓慢细流冲掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸馏水变为无色为止，其中，瑞氏‑姬姆萨A液为常规血细胞染色用瑞氏染液和姬姆萨1:1混合液，瑞氏‑姬姆萨B液为pH＝6.4～6.8的磷酸盐缓冲液；(5)脱色洗片：把染好的玻片浸入甲醇溶液中脱色洗片1～3min；(6)脱水及封片：脱色的洗片依次经过70％、80％、95％、100％梯度酒精分别脱水2min，然后分别经二甲苯纯酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性树胶封片。