一种基于G蛋白信号放大系统的细胞膜受体电化学型传感器的制备方法

摘要

本发明公开了一种基于G蛋白信号放大系统的细胞膜受体电化学型传感器的制备方法。本发明通过膜蛋白提取液提取雄性柞蚕蛾触角上的性诱激素受体，并将其自组装到猪味蕾组织的细胞膜上，然后进行固定化，制成三明治式核微孔测定膜，最后将膜片固定到玻碳电极上，制成受体传感电极。该电极可以通过三电极系统和电化学工作站进行测定。利用循环伏安法、交流阻抗法表征电极组装的各个阶段，利用计时电流法进行测定，结果表明：此方法对柞蚕性诱激素的最低检测限为：1×10^‑14mol/L，在1×10^‑14mol/L～1×10^‑3mol/L极宽的浓度范围内柞蚕性诱激素的响应电流与其浓度呈现良好的线性关系。

主权项

一种基于G蛋白信号放大系统的细胞膜受体电化学型传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)收集雄性柞蚕触角共225mg，于冰上剪碎后加入1mL裂解缓冲液，混合倒入玻璃匀浆器匀浆50次，于冰上静置5min，使用超声波破碎仪破碎10min，将匀浆液转移至预冷的离心管中离心，在4℃,3000rmp条件下离心5min，取离心所得沉淀，加入200uL膜蛋白抽提专用缓冲液，涡旋振荡30s混匀，于冰上静置5min，反复5次后再次离心，在4℃,12000rmp,条件下离心10min，取上清液转移至新管，即为雄性柞蚕蛾性诱激素受体粗提物；(2)将中性酶Ⅱ与蛋白酶Ⅱ混合酶液：即1mg/mL的胶原酶Ⅱ与3mg/mL的中性蛋白酶Ⅱ，1:1混合，放入培养箱中进行提前预热，在37℃，预热15min，以便使酶活性达到最高；取新宰杀的猪舌头，用医用剪刀剪至叶状乳头边缘处，用解剖液清洗洗净舌头表面的血迹，放入干净的解剖液中；取提前预热的0.3‑0.5mL37℃的混合酶液注入猪舌上皮与其肌肉层之间，注射时注射器的针头一直伸至舌尖部位，注射时注射器要慢慢向后抽出，完成后放入解剖液中室温孵育6‑8分钟；然后用眼科镊子将舌上皮与肌肉层轻轻剥离，将剥离的味蕾组织立即放入冰浴的解剖液中备用；(3)取出味蕾组织放入雄性柞蚕蛾性诱激素受体粗提物中，在4℃条件下自组装0.5‑1hr后取出，放入冰浴试管中备用；(4)将可溶性淀粉溶解于含1％戊二醛的水溶液中，80℃水浴加热并搅拌30min,配成1‑2g/100mL浓度的淀粉溶液；淀粉溶液室温下放置过夜，使淀粉与戊二醛得到充分交联，获得醛基化淀粉胶溶液；醛基化淀粉胶溶液再与1‑2g/100mL的海藻酸钠溶液以1:1混合；取上述混合溶液10‑20ul均匀涂抹于2张直径为25mm、孔径为0.22um的聚碳酸酯核微孔膜上，将准备好的0.05～0.15g自组装了雄性柞蚕性诱激素受体的味蕾上皮组织正面朝上放置于一张微孔膜的圆心上，然后将另一张微孔膜覆盖其上制成三明治结构核微孔测定膜；将制成的测定膜浸入质量百分数5％的CaCl₂溶液中10s后取出，以使海藻酸钠与CaCl₂发生离子交换反应，形成稳定的螯合物，使海藻酸钠溶液瞬时凝胶化，成为良好的固定剂；然后用pH＝7的0.01mol/L的磷酸缓冲液冲洗味蕾组织膜，去除膜上存留的Cl^‑、Ca²⁺，消除其带来的测定误差；最后，将膜的正面朝上使得味蕾组织与预处理完的玻碳电极芯重合，用皮套将膜固定在玻碳电极测定端的表面，自组装柞蚕性诱激素受体猪味蕾组织传感器制成。