一种鸭胚早期性别鉴定方法及专用试剂盒

摘要

本发明属于家禽性别检测技术领域，具体涉一种鸭胚早期性别鉴定的方法及专用试剂盒。本发明通过采集孵化早期鸭胚尿囊液，利用针对雌二醇检测的单克隆抗体，及抗原抗体反应，建立鸭胚早期性别鉴定方法。根据雌性胚胎中雌二醇含量高于1ng/ml，雄性胚胎中雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定雌雄性别。本发明可以在孵化早期鉴定雌雄性别并且不影响胚胎的继续发育，有益于动物福利和降低垂直疾病的传播。

主权项

一种鸭胚早期性别鉴定的间接ELISA方法，其步骤包括制备酶标板和样品处理，其特征在于下列步骤:(1)从孵化机中取出鸭胚，大头向上，静置3‑5min，利用照蛋器照蛋，寻找抽取尿囊液的定位处，在定位开口抽取尿囊液的区域，避开血管分布处，定位后做上标记，用75％酒精溶液消毒开口处，以一次性针头刺穿蛋壳后再用一次性无菌注射器或移液器伸入蛋壳抽取尿囊液，注入无菌EP管，得到尿囊液样品，保存于‑20℃冰箱备用；(2)配制ELISA核心试剂，该核心试剂包括：雌二醇蛋白包被的酶标板，雌二醇单克隆抗体，标准品，标准品稀释剂，显色剂，终止液，洗涤液和酶标二抗；所述的标准品为雌二醇，所述的标准品稀释剂为含有1％氯化钾的1×磷酸盐缓冲液，所述的显色剂为3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，所述的终止液为2mol/l的稀硫酸，所述的洗涤液为0.01mol/L PBST；所述的酶标二抗为山羊抗小鼠IgG；按如下步骤制备得到：1)ELISA酶标板的包被：以雌二醇蛋白作为抗原，用pH 9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液稀释至包被浓度0.2μg/mL，包被ELISA酶标板，加入封闭液，制备包被好的酶标板；2)山羊抗小鼠酶标二抗的制备：将山羊抗小鼠IgG‑HRP酶标抗体，用1×磷酸盐缓冲液按体积比1:600稀释成工作浓度，再用0.22μm的滤膜过滤除菌，无菌分装后置2～8℃保存备用；3)显色剂的制备：将3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶于二甲亚砜制成；4)终止液的制备：将浓硫酸配制为2mol/L的稀硫酸；5)洗涤液的制备：a.储备液A液和储备液B液0.2mol/L的储备液A液：将6.2404g的NaH₂PO₄·2H₂O溶于200ml ddH₂O中；0.2mol/L的储备液B液：将71.628g的Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000ml ddH₂O中；b.0.01mol/L的PBST缓冲液将0.2mol/L的储备液A液47.5ml，0.2mol/L的储备液B液202.5ml，ddH₂O 4747.5ml，NaCl 45g，1N的NaOH 10ml和吐温‑20 2.5ml，混合；6)封闭液的制备：将5g脱脂乳溶于100ml洗涤液中得到封闭液；(3)标准品浓度梯度的确定及检测步骤：1)标准品浓度梯度的确定：设置标准品梯度浓度依次为0ng/ml，0.05ng/ml，0.15ng/ml，0.45ng/ml，1.0ng/ml和2.0ng/ml；2)检测步骤：a.将配制的核心试剂及收集的待测样品鸭胚尿囊液移至20‑25℃室温下进行平衡至少30min；b.取一块酶标板，在酶标板的每孔中依次添加标准品浓度梯度试剂，然后按顺序在每孔中加入待检鸭胚尿囊液50μL，此后再加入雌二醇单克隆抗体50μL，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；c.取出步骤b的酶标板，甩干酶标板孔内的液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；d.向酶标板的孔中加入100μL山羊抗小鼠IgG‑HRP，用板贴封板，轻轻震荡混匀，于37℃反应30min；e.取出酶标板，甩干孔内液体，按250μL/孔的量用稀释好的洗涤液洗板4次，每次浸泡30秒，在吸水纸上拍干；f.在酶标板的每孔中加入显色剂100μL，轻轻震荡，于37℃避光显色15min；g.向酶标板的每孔中加入终止液50μL，当酶标板的小孔中的颜色由蓝色转为黄色时判定为终止反应；h.加入终止液后5min内立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值；i.标准曲线公式的拟合：Y＝1.6474X²‑3.662X+0.6417和Y＝1.3414X²‑3.4603X+0.6809；(4)结果判定将待测样品的OD值带入i步骤所示的公式得到样品中雌二醇的含量；当测定的样品中的雌二醇含量高于1ng/ml时，判定为雌性；当测定的样品中的雌二醇含量低于0.6ng/ml，判定为雄性。