冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法

摘要

本发明涉及一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法。本发明方法以抗MTG兔多抗为包被抗体，抗MTG鼠单抗为检测抗体，再结合HRP标记的抗IgG1二抗，构成双抗体夹心ELISA检测方法，对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测。本发明方法检测限为20ng/mL，该检测方法在0.6mg/mL～10mg/mL范围内OD₄₅₀值与MTG浓度的log值呈线性关系，冷冻鱼糜样品添加回收率为94％以上，板内变异系数为1.12％～4.02％，板间变异系数为5.43％～6.87％。本发明方法灵敏度高，样品前处理简便，适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测，防止冷冻鱼糜原料掺假。

主权项

一种冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：①包被：抗MTG兔多抗用包被缓冲液进行稀释至1‑3μg/mL，以每孔100μL的量加入酶标板进行包被，4℃冰箱反应12h；所述包被缓冲液为0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液；②洗涤：将酶标板甩干，每孔加入200μL洗涤液，振荡3min，甩干液体并拍干酶标板，重复洗涤3次；所述洗涤液为含0.05％(v/v)Tween‑20的0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液；③封闭：每孔100μL封闭液，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；所述的封闭液为含0.5％(m/v)BSA的洗涤液；④加抗原：抗原样品与样品稀释液在乳化机作用下匀浆3min，得到的浆液磁力搅拌12h，之后再6000rpm离心15min，取上清液再次以6000rpm离心15min，离心得到的上清液即为待测样品；每孔加入100μL待测样品，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；所述的样品稀释液为0.05mol/L pH8.0 Tris‑HCl缓冲液；⑤加检测抗体：抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100μL，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；所述的抗体稀释液为含0.5％(m/v)BSA的洗涤液；所述抗MTG鼠单抗用抗体稀释液进行稀释至0.05‑0.15μg/mL；⑥加酶标二抗：酶标二抗用抗体稀释液进行稀释，每孔加入100μL，37℃烘箱反应1h，反应结束后重复上述洗涤步骤；酶标二抗用抗体稀释液进行稀释至1:5000‑1:6000；⑦加显色液：将显色A液、显色B液、30％H₂O₂以200:5000:1的比例混合，每孔加入100μL，37℃烘箱反应15min；所述的显色液A液为5mg/mL的TMB二甲亚砜溶液；所述的显色液B液为pH 5.0柠檬酸缓冲液；⑧加终止液：每孔加入100μL终止液，用酶标仪测定OD₄₅₀值；所述的终止液为2mol/LH₂SO₄溶液；⑨按①‑⑧的检测方法进行操作，绘制双抗体夹心ELISA法MTG浓度测定曲线，以抗原浓度的log值为横坐标，各孔的OD₄₅₀值为纵坐标；⑩掺假冷冻鱼糜按0.6mg/mL～10mg/mL进行稀释处理，然后按照①‑⑧的检测方法进行操作，通过标准曲线计算测定浓度。