鉴定芥蓝齐口期DNA甲基化基因的方法

摘要

本发明公开了一种芥蓝菜齐口期DNA甲基化相关基因的鉴定和分离方法，发明人利用MSAP技术并结合芥蓝菜的生物学特性，通过6个分期播种的3种生态类型芥蓝，调查齐口期变化，利用MSAP分析齐口期DNA甲基化水平变化，从而鉴定和分离DNA甲基化相关基因。研究表明，芥蓝菜总体上去甲基化水平略高于全甲基化水平，以去甲基化为主。将秋播和春播间差异的30条MSAP片段进行分离和测序，结果证实，8条片段与已知具有功能特征的基因高度同源，目前没有这些基因曾参与DNA甲基化的报道，而通过MSAP检测出这些基因参与芥蓝齐口期DNA甲基化调控，意味着这些基因具有DNA甲基化调控功能。

主权项

一种芥蓝菜齐口期DNA甲基化相关基因的鉴定和分离方法，其特征在于：通过分期播种不同熟性的芥蓝，调查齐口期变化，然后利用MSAP分析齐口期DNA甲基化水平变化，从而鉴定和分离DNA甲基化相关基因；所述分期播种是指分期秋播和春播，秋播包括早秋播、中秋播和晚秋播三期，春播包括早春播、中春播和晚春播三期；所述不同熟性的芥蓝包括早熟生态型的尖叶夏芥蓝、中熟生态型的中花芥蓝和晚熟生态型的迟花芥蓝；包括以下步骤：<1>分期播种三种熟性芥蓝选用早、中、晚3个生态型芥蓝品种尖叶夏芥蓝、中花芥蓝和迟花芥蓝，通过早秋播、中秋播、晚秋播和早春播、仲春播和晚春播6个处理，创造齐口期变化；<2>提取DNA分别提取步骤<1>中三种生态型芥蓝品种在6个处理下的DNA；<3>MSAP分析步骤<2>中各处理基因组DNA分别用两对限制性内切酶EcoRI/HpaII和EcoRI/MspI进行酶切并同时进行连接反应；取5μL酶切连接产物进行预扩增反应，将预扩增PCR产物稀释30倍后用做选择性扩增底物；选择性扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色；所述选择性扩增按以下操作进行：反应体系为20μL：5μL预扩增反应稀释产物，10x PCR Buffer，2mmol/L Mg²⁺，0.5μmol/L EcoRI和HpaII/MspI引物，0.2mmol/LdNTP，0.05U/μl TaqDNA聚合酶；反应条件为：94℃5min；94℃30S，65℃30S、‑0.7℃每个循环，72℃lmin，13个循环；94℃30S，56℃30S，72℃lmin，24个循环；72℃7min；4℃保存；<4>数据分析对数据分析结果进行DNA甲基化基因多态性分析，鉴定和克隆相关基因序列。