高效分离和培养海马神经元的方法

摘要

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种神经元分离和培养方法及试剂。本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，改进当前海马神经元体外分离和培养的方法，解决了海马神经元原代培养的增殖性和活性无法保持的问题。本发明建立了一套比较成熟的体外培养海马神经元的方法，本发明得到的神经细胞数量充足，生长状态较好，能够从哺乳动物的海马组织中分离出高活性、高数量的海马神经细胞，符合原代海马细胞培养的要求，可满足神经科学研究中细胞生物学实验的需求。

主权项

一种海马神经元的分离和原代培养方法，包括以下步骤：(1)漂洗：取离体哺乳动物的海马组织，置冰浴的漂洗液中，去除红细胞、被膜及结缔组织，用漂洗液冲洗2～5次；所述漂洗液，经过如下步骤得到：2g海藻糖、3g葡萄糖和10mL双抗溶于100mL D‑Hank′s液中，混匀，加D‑Hank′s液定容至1000mL，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用；所述D‑Hank′s液，经过如下步骤得到：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.12g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃0.35g，依次将各成分溶解于约500mL三蒸水中混匀，加三蒸水定容至1000mL，调整pH值至7.2～7.4，分装，高压灭菌，分装，4℃保存备用；所述双抗是100×青霉素‑链霉素溶液：青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL；(2)消化：将步骤(1)漂洗后的海马组织剪成直径1mm³小块，用5倍组织体积的消化液37℃作用5～10分钟，组织成粥糜状，用细胞种植液终止消化，轻轻吹打至组织块10次以分散细胞；所述消化液，经过如下步骤得：1.0g胰蛋白酶和0.1g EDTA溶于100mL D‑Hank′s液中，混匀，加D‑Hank′s液定容至1000mL，0.22μm滤膜过滤除菌，0.4MPa大气压下溶入氢气4～6小时，氢气终浓度达到为0.5mmol/L，γ射线消毒灭菌，分装，4℃保存备用；所述细胞种植液，经过如下步骤得到：DMEM/F12培养基加入胎牛血清、活性发酵滤液和双抗，使胎牛血清终浓度为10％、活性发酵滤液终浓度为0.2％，双抗终浓度为1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用；所述双抗，制备方法同步骤(1)；所述活性发酵滤液，经过如下步骤得到：①短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)LJM‑006，该菌株已于2011年10月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5418；②短双歧杆菌LJM‑006采用改良MRS培养基培养，培养基配方为：以重量计，取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，MnSO₄.4H₂O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，吐温‑801mL，蒸馏水1L，加热溶解校正pH值至6.5，115℃高压灭菌15‑20分钟；③将短双歧杆菌LJM‑006接种于冷却至40±2℃的步骤②改良MRS培养基中，菌种接种量为0.2～0.5％，35±2℃厌氧培养24小时，用分光光度计测定上述培养液A_580nm值为1.2时，将上述培养液在转数5000～8500rpm下离心10分钟后，取上清液，0.22μm滤膜过滤除菌，即得到活性发酵液滤液，4℃保存备用；(3)制备细胞悬液：收集步骤(2)消化后初次细胞悬液，经200目细胞筛过滤后，800～1000rpm4℃离心5～10分钟，弃去上清液，加入细胞种植液，重悬细胞，制成5×10⁵～10×10⁵个/mL的单细胞悬液；所述细胞种植液，制备方法同步骤(2)；(4)接种、培养：将步骤(3)细胞悬液种植于预先铺好多聚赖氨酸的培养皿及培养瓶中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中，种植后24～72小时换成细胞维持液，之后每隔两天用细胞维持液换液，每次更换的量为原体积的1/2；所述细胞维持液，经过如下步骤得到：Neurobasal培养基加入B₂₇和谷氨酰胺，使B₂₇终浓度为2％，谷氨酰胺终浓度1％，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。