含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库

摘要

本发明公开了一种含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，涉及经过遗传基因改造的微生物对遗传毒性致癌物的检测。结合流式细胞仪分选技术、深度测序技术建立一种高通量筛选遗传毒性相关易感基因的方法。本发明的优点在于，可以检测遗传毒性化合物，且高通量，针对性强，操作简便。这种以遗传毒性检测灵敏度检测为基础的筛选与遗传毒性效应相关的易感基因群的文库，其应用前景：一方面可作为分子工具研究这类影响检测系统灵敏的基因的遗传表达与外源遗传毒性化合物的暴露间的相互作用关系，另一方面可通过生物信息学分析，可将酵母的遗传毒性相关易感基因与人类的癌症易感基因建立关联，为提高环境健康风险评价水平提供新方法。

主权项

含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库，其特征在于，基于该文库的全基因组筛选遗传毒性化合物易感基因的方法包含以下步骤：一、含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的构建：a、将分别含有RNR3‑yEGFP或HUG1‑yEGFP遗传毒性生物传感器的BY4347野生型酵母细胞过夜培养的菌液在SD‑Lue长形固体培养平板中涂布，菌液尽量要浓，涂布一定要均匀，放入30℃培养箱生长2天；其中：SD‑Lue平板的制备方法：称取1.7 g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵, 5 g硫酸铵，0.69 g 缺亮氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，定容至0.95 L，再加入20 g琼脂粉；高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖至其终浓度为2%；b、利用克隆复制仪以及1536位点针板分别将含有YCp111‑ HUG1‑yEGFP和YCp111‑ RNR3‑yEGFP重组质粒的BY4347菌复制在新鲜的SD‑Lue固体平板上，30℃培养1天，形成1536个重组菌克隆；c、由于5000多个单基因缺失酵母突变株保存在4个1536位点的固体平板上，每个位点上即是一个特异的单基因缺失突变株；利用克隆复制仪将单基因酵母突变菌株、含有遗传毒性检测系统的BY4347菌株克隆分别按先后复制在一个新的YAPD固体平板上进行杂交，30℃培养1天；其中：YAPD平板的制备方法：称取20 g 胰蛋白胨，10 g酵母浸粉，120 mg 腺嘌呤溶于双蒸水中，定容至0.95 L，再加入20 g琼脂粉；高压蒸气灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖至其终浓度为2%；d、将杂交后酵母细胞复制到含有G418抗性的SD‑Lue营养缺陷固体平板上，进行双倍体筛选，30℃培养2天；其中：SD‑Lue+G418平板的制备方法：称取1.7 g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵, 5 g硫酸铵，0.69 g 缺亮氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，定容至0.95 L，再加入20 g琼脂粉；高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖至其终浓度为2%，待培养基温度降至50‑60℃加入过滤灭菌的G418溶液至终浓度为200毫克/毫升；e、重复步骤1d的抗性、营养型筛选，即再次将菌株复制在新鲜的含有G418抗性的SD‑Lue营养缺陷固体平板上，富集含有YCp111‑ HUG1‑yEGFP和YCp111‑ RNR3‑yEGFP的杂合单基因缺失突变菌株，30℃培养1天；f、将步骤1e筛选培养的双倍体突变菌株复制在出孢培养基中，潮湿环境中22℃培养5天；其中出孢培养基的配制方法：称取20 g琼脂糖溶于双蒸水中，定容至0.95 L，高压蒸汽灭菌后加入50 mL已过滤灭菌的3g/L储液形式存在的醋酸钾溶液以及1mL已过滤灭菌的20%棉子糖储液；g、在含有canavanine, S‑AEC, G418筛选抗性的SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys营养缺陷型培养基中筛选还有MATα结合型的单倍体突变菌株，30℃培养3天；其中SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys+ canavanine+S‑AEC+G418平板的制备方法：称取1.7 g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵, 1 g MSG，1.6 g 缺亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，定容至0.95 L，再加入20 g琼脂粉； 高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖至其终浓度为2%，待培养基温度降至50‑60℃加入canavanine溶液至终浓度为50毫克/毫升，S‑AEC溶液至终浓度为50毫克/毫升及G418溶液至终浓度为200毫克/毫升；h、在含有canavanine, S‑AEC, G418，hygromycin B筛选抗性的SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys营养缺陷型培养基中再次筛选MATα结合型的单倍体突变菌株，30℃培养2天；其中SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys+canavanine+S‑AEC+G418+hygromycin B平板的制备方法：称取1.7 g酵母氮源无氨基酸无硫酸铵, 1 g MSG，1.6 g 缺亮氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的氨基酸混合物溶于双蒸水中，定容至0.95 L，再加入20 g琼脂粉；高压蒸汽灭菌后，加入已减压灭菌好的40%葡萄糖至其终浓度为2%，待培养基温度降至50‑60℃加入canavanine溶液至终浓度为50毫克/毫升，S‑AEC溶液至终浓度为50毫克/毫升，G418溶液至终浓度为200毫克/毫升及hygromycin B溶液至终浓度为300毫克/毫升；i、重复步骤1h，继续30℃培养2天；二、基于含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库的全基因组筛选遗传毒性化合物易感基因方法的建立：a、利用涂布棒，加入SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys+ canavanine+S‑AEC+G418培养基将上述含有遗传毒性生物传感器的酵母单基因缺失文库中的所有克隆进行刮板，混合；b、取刮板后的酵母单基因缺失遗传毒性检测文库中的所有克隆混合液，接种于SD‑Leu‑Arg‑His‑Lys+ canavanine+S‑AEC+G418培养基中稀释至细胞密度OD₆₀₀为0.5，在30℃、200转/分钟的条件下，振荡培养12小时，得到酵母单基因缺失遗传毒性检测文库克隆混合液；c、将12小时培养后的酵母菌液用新鲜的YPD选择性培养液稀释到细胞密度OD₆₀₀为0.1，加入待测得遗传毒性化合物MMS，培养8小时；d、取出经MMS受试培养8小时后的酵母单基因缺失遗传毒性检测文库克隆混合液，4000转/分钟 离心2分钟，弃上清；加入新鲜PBS溶液，悬浮沉淀物；再次4000转/分钟 离心2分钟，弃上清；重新加入新鲜PBS，至细胞密度OD₆₀₀为0.2；e、加入终浓度为1毫克每毫升的溴化丙啶溶液3微升，混匀，置于冰上，黑暗保存直至使用流式细胞仪进行分选；f、利用流式细胞仪对样品进行检测；同时设定FITC及PE两激光通道，微调电压, 将低、中、高三种荧光强度信号门中细胞进行分选，分别分选到约10⁷个细胞；g、从分选后酵母菌株细胞中提取基因组DNA；h、扩增标记单基因缺失的条形码序列；利用PCR技术，以4a中提取的分选后酵母菌株细胞中提取基因组DNA作为扩增模板，通过上游引物U1: GAT GTC CAC GAG GTC TCT和下游引物D1: GCG CGC CTT AAT TAA CCC GG，将一段93bp的DNA片段扩增出来，其中包含标记单基因缺失的条形码序列；其中：PCR 的条件为：94℃ 3分钟；94℃ 15秒，55℃ 15秒，72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 3分钟；i、采用高通量的Illumina测序技术对不同荧光强度样品中的标记单基因缺失的条形码序列TAG1的DNA进行双末端测序；j、得到不同荧光强度样品中标记单基因缺失的条形码序列信息后，利用已知的TAG1序列与所得到的序列做比对，当测序所得TAG1序列与已知TAG1的序列完全匹配时，即认为测序所得结果为标记单基因缺失的条形码序列；k、采用相对丰度和荧光细胞百分比两个参数对所得到的特异条形码序列进行定量分析；定义如下：整体相对丰度RF = (NH+NM+NL)/NA*100；高荧光相对丰度RFH = NH/NA*100；中荧光相对丰度RFM = NM/NA*100；低荧光相对丰度RFL = NL/NA*100；整体荧光细胞百分比PCF = (NH+NM)/(NH+NM+NL)；高荧光细胞百分比PCFH = NH/(NH+NM+NL)；中荧光细胞百分比PCFM = NM/(NH+NM+NL)；其中NA为测序所得含有TAG1序列的总数目；而NH, NM, NL分别是在不同荧光强度样品所得到的特异条形码的数目。