一种日本囊对虾G642A单核苷酸多态性位点的筛选及检测方法

摘要

一种日本囊对虾G642A单核苷酸多态性位点的筛选及检测方法，涉及日本囊对虾。采用PAMSA方法设计特异性引物，可方便、快捷通过聚丙酰胺凝胶电泳进行日本囊对虾单核苷酸多态性标记验证及基因分型，并具有筛选检测费用低、操作简便快速等优点，有利于日本囊对虾系谱鉴定、遗传连锁图谱构建等研究开展。可在没有已知的日本囊对虾基因组DNA单核苷酸多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，利用生物信息学分析筛选G642A单核苷酸多态性位点；并采用PAMSA方法设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成日本囊对虾G642A单核苷酸多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

主权项

一种日本囊对虾G642A单核苷酸多态性位点的筛选及检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)提取20个日本囊对虾个体的肝胰腺总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接日本囊对虾肝胰腺参考转录本，比对定位测序读端到参考转录本筛查单核苷酸多态性位点，并筛选比对质量分数大于40、次要等位基因频数在200以上、次要等位基因频率高于20％的位点为候选序列；2)其候选comp11169的基因序列为：GATGTCGTATTAATGTCTTTATCCAATTAAAAAATCATCATTTATAATTCTAAGCATCTGACGACTATAATATGTAGGTATAACATTGTACTTATACATGGAGAGTCGAAATCTTGAATCATTTAACCTGTTCCTACAATATCACAAGAGACAAGTAATTGAACCAATCACAATCACAAAAGTAAAGGAAAGAAAGATAGAAAAAAAAAGCAAGCGAAGGAGAAATACATATAAATGTTTCCAACTCTTCCCAACCGCCTTTTAGAAGCGCGCCATTTTTTTTACTTCCTGCGCGCGCATTCGCTGGCGTACAAATTGTTAATCTGGTTGGCGTCGCTCTGCTCCATGTGATCCTTGTCGTAGGCCTCGACGAGAATCACGTTAGGATCCGTGGGCACGATGGTTTCGGCGACGCCCCAGTTCACGGAGAAGGAGTAGGTGCCGTAGTGCATGATGCTCTCGTAGTTGTATCCTTCGCCCACGTACTGCCAGTAGGAGTCCTTGTTGAACTGGGACTCCATGCCAGGCTGCACATTTTCGAAGTGAATAGTGACGTAGTAGTCGCGGTCGTTACGGGTGTGCTCGTGGTAGAAGCCGACAGCGTGCATGAGCTCGTGGATGGCCGTGCCCTTGTAGATGCACCGTTGCTGTCTAGAGAGACCCTCTGCTTGCCTCCAATGGTGCCTACGTATGACCAGCATCCGCTGTCGTTCGTGACGATTTCGATGTAGTTGCCCTGAGTGGTTCTCTCGACGAAGCGGATGCAGGTGCGGGCGTGGAAGTCGTCCATCGCGGAGAGGATGAGGGACCTCTGGTAGCTGGTGACAGAACTGCCAAACACATAGGGAACGACTCCACCGGGCCACAAGTACTGCTCCCCAAGGATGGCAGCGCGTTCCTTCCCTGGTTCCTGTCCTGCAATACCCTTAATGTCACCCTGGAAGAGGTCAGGGTTGTACATGGCCTGAGCCGCCCTTGGGACAACAGGGGTCGCGCCGGCCACGGCCACGACTGCAAGTAAGGCAACGAGCAACATGCTGGTGCGAAGATGAAGGAGAAAGAGAGGAAACGTGT，其中加粗、加下划线的碱基为候选G642A_SNP位点；3)采用PAMSA方法设计特异性引物为：正链引物一：5’‑TAAAACGTGCCCTTGTAGATGAAG‑3’；正链引物二：5’‑AAAACCCCTAAAACGTGCCCTTGTAGATTCAA‑3’；负链引物：5’‑TTCGTCGAGAGAACCACT‑3’；4)提取日本囊对虾背部肌肉的基因组DNA，将其稀释为50ng/μL；5)PCR扩增；6)聚丙酰胺凝胶电泳检测分型：将PCR扩增反应产物进行6％变性聚丙酰胺凝胶电泳，并使用银染进行检测分型，在凝胶成像系统下观察，若某一个单核苷酸多态性位点在不同的个体中可以扩增出长度差异为8个碱基大小的2种片段，则可认为该位点为多态位点，其中单个条带的个体为纯合体，两个条带的个体为杂合体，可根据片段长度准确判定个体的基因型。