表达C₃₀类胡萝卜素的重组枯草芽孢杆菌

摘要

本发明涉及能够合成30个碳原子(C₃₀)的类胡萝卜素4，4′‑二脱辅基链孢红素(4，4’‑diaponeurosporene)重组枯草芽孢杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了含有C₃₀类胡萝卜素合成酶基因(crtm和crtn)的枯草芽孢杆菌表达质粒pMK3‑crtmn(能够在枯草芽孢杆菌中表达C₃₀类胡萝卜素合成酶Crtm和Crtn)，并成功电击转化入枯草芽孢杆菌WB800中。转化后的WB800菌体由原来的白色变为黄色。提取重组WB800中的色素成分经高效液相色谱(HPLC)鉴定为4，4′‑二脱辅基链孢红素。4，4′‑二脱辅基链孢红素能够刺激树突状细胞成熟，产生的细胞因子(IL‑6、IL‑10、IL‑12p70和TNFα)量增加，并且具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力。口服能够合成4，4′‑二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌可以显著降低葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎症状。这种能产4，4′‑二脱辅基链孢红素的枯草芽孢杆菌有望开发成为一种预防结肠炎的益生菌。

主权项

一种C₃₀类胡萝卜素合酶表达质粒pMK3‑crtmn，是由以下方法构建而成：1.1 C₃₀类胡萝卜素合成酶基因的克隆参照已发表的金黄色葡萄球菌参考菌株基因组序列(GenBank登陆号：NC_007795.1)，设计一对扩增crtm和crtn的引物。此引物扩增的序列包含了位于crtm阅读框上游的启动子部分，并在上、下游引物5端分别引入15个碱基的同源臂序列(下划线为同源臂)，引物序列如下：P1：5’‑TGATTACGCCAAGCTGCATTTGGACCGGTGACATTAACAA‑3’P2：5’‑GAATTCCCGGGGATCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTATACG‑3’以金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)提取的基因组DNA为模板，用合成的P1、P2引物PCR扩增crtm的启动子及crtm和crtn基因，PCR反应体系均为50μL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30个循环，72℃ 10min，4℃ 10min。回收扩增产物。1.2 pMK3‑crtmn质粒的构建用限制性内切酶HindIII和BamHI将pMK3质粒线性化。反应条件为HindIII和BamHI各2ul，10×buffer 4ul，pMK3质粒1ug(4ul)，超纯水28ul，37℃ 2小时。将酶切产物回收得到线性化的pMK3质粒。将线性化的pMK3质粒与P1，P2引物的扩增产物按照连接试剂盒(ClonExpress^TM II One Step Cloning Kit)说明书进行连接，得到pMK3‑crtmn质粒，酶切鉴定并测序。