一种基于Ion PGM^TM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用

摘要

本发明公开了一种基于Ion PGM^TM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法、试剂及其应用，构建过程包括目标区域扩增、引物及修饰清除、接头连接、磁珠纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序等步骤。本发明还提供一种用于构建基于Ion PGM^TM测序平台的扩增子DNA文库的多重PCR扩增目标区域试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂。本发明步骤简单，目标区域富集后通过一次的PCR扩增，然后采用磁珠纯化产物，即得到测序文库；同时降低了建库的成本，减少了由于PCR扩增中引入突变的可能。使得测序质量更佳精确。

主权项

一种基于Ion PGM^TM测序平台的扩增子DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)目标区域扩增：将待测样本的DNA、针对目标区域设计的多重PCR扩增引物以及多重PCR扩增目标区域试剂混合进行PCR扩增反应；(2)引物、修饰清除：将步骤(1)所得到的反应产物与MPclean试剂混合进行反应；(3)接头连接：将步骤(2)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接头连接反应；(4)磁珠纯化：将步骤(3)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到DNA文库；(5)文库扩增：将步骤(4)所得到的DNA文库加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，并进行磁珠纯化得到目的DNA文库；(6)文库检测：将步骤(5)所得到的目的DNA文库采用Qubit检测文库浓度；(7)高通量测序：对步骤(6)所得到的合格文库按照等浓度混合并进行Agilent Bioanalyzer 2100质检，质检后Ion PGM^TM平台进行高通量测序；其中，步骤(1)中所用的多重PCR扩增目标区域试剂pH值为7.5‑7.7，溶剂为水，溶质为：1‑3U/μL High‑Fidelity DNA Polymerases、8‑12mM的Tris‑HCl缓冲溶液、45‑55mM的NaCl溶液、8‑12mM MgCl₂、2‑4mM二硫苏糖醇、8‑12mM dNTPs混合液；步骤(2)中所用的MPclean试剂为针对引物特定修饰的清除试剂；步骤(3)中接头连接反应试剂由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300‑500U/μL的T₄ DNA Ligase和6‑10U/μL的Bst WarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7.5‑7.7，溶剂为水，溶质为：pH8.0的45‑55mM Tris‑HCl缓冲溶液、8‑12mM的KCl、8‑12mM二硫苏糖醇、0.5‑2mM的ATP、1‑3nM的dNTPs混合液、8‑12mM的(NH₄)₂SO₄、1‑3mM的MgSO₄；步骤(4)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠；步骤(5)中所用的扩增试剂pH值为7.5‑7.7，溶剂为水，溶质为：1‑3U/μL Hot Start High‑Fidelity DNA polymerase、pH8.8‑9.0的64‑68mM的Tris‑SO₄、18‑22mM的(NH₄)₂SO₄、1‑3mM的MgSO₄、200‑240μM dNTPs混合液。