一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法

摘要

本发明公开了一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法，属于生物技术领域。本发明的具体鉴定方案为：1.提取囊胚单细胞；2.提取基因组DNA；3.通过Nested PCR扩增目的基因片段；4.回收目的基因；5.目的基因通过连接到骨架载体，转化感受态细胞后涂布到铺有LB固体培养基的培养皿；6.测序验证基因敲除结果。本发明的方法鉴定非人灵长类动物的囊胚基因敲除结果后，再将囊胚移植给代孕动物，可提高出生动物基因敲除的效率；缩减了实验使用受精卵的数量，降低了实验经费；为濒危的珍稀灵长类动物转基因技术研究提供经验借鉴。

主权项

一种非人灵长类动物囊胚基因敲除的鉴定方法，其特征在于：具体的步骤如下：(1)提取囊胚单个细胞：利用piezo显微操作针冲击透明带，取单细胞；这种单细胞提取方式极大地减少了细胞的损伤，提高动物克隆操作的成功率；(2)基因组DNA提取：用SIGMA的GenemePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit试剂盒提取基因组DNA；(3)Nested PCR扩增目的基因片段：设计两对引物扩增目的基因，利用TaKaRa Ex进行PCR反应；(4)参照QIAGEN的QIAquick PCR Purification Kit说明书回收得到目的DNA片段；(5)连接载体：利用TAKARA的DNA Ligation Kit Ver.2.1将SHANK3基因连接到PMD18‑T载体上，转化DH5α后涂布到铺有LB固体培养基的培养皿中37℃培养12h，次日挑单克隆菌落加到LB液体培养基中摇菌过夜；(6)测序：收集菌液利用TINGEN TIANprep Mini Plasmid Kit试剂盒提取质粒，测序验证敲除效果。