一种PRP/MSCs/牡蛎壳骨组织支架材料的制备方法

摘要

一种PRP/MSCs/牡蛎壳骨组织支架材料的制备方法，本发明以以牡蛎碳酸钙作为支架、MSCs作为种子细胞、PRP作为内源性生长因子构建组织工程骨，采用用牡蛎壳作支架、骨髓基质细胞作种子细胞、富血小板血浆作内源性生长因子构建的组织工程骨修复骨缺损效果良好，与自体骨移植相近，是较理想的骨移植替代材料，方法简便，膜片包裹牡蛎壳支架形成的膜‑支架复合体具有良好异位成骨能力，具有良好的生物相容性，对细胞良好的粘附能力，能保持细胞的正常生长、分化、增殖以及合成分泌功能，具有适当的生物降解速率，材料及其降解产物对机体无毒副作用，具有良好的物理、化学和机械性能。

主权项

一种PRP/MSCs/牡蛎壳骨组织支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）牡蛎壳支架预制备：取牡蛎壳，冲刷风干，将牡蛎壳碾压粉碎至颗粒状，先用40目后用 100目过滤筛过滤，得到 100 目以下的颗粒，然后将牡蛎粉置于10% 氯仿溶液中浸泡 24h，密封，并搅拌，24h后用蒸馏水冲洗3遍，过滤，然后将牡蛎粉加入30% 双氧水中浸泡 24h，并搅拌，其后蒸馏水浸泡、冲洗、过滤，反复3遍，最后自然风干，将牡蛎壳粉浸泡在无菌生理盐水中，用超声数控机去除牡蛎壳粉中的杂质，并在37℃恒温条件下干燥，密封保存；（2）牡蛎壳支架的制备：在超声振荡，40℃的条件下，于搅拌器中加入无水乙醇，向无水乙醇中以1:3质量比添加牡蛎壳粉和α‑半水硫酸钙，振荡20min 后，两者混合均匀使α‑半水硫酸钙均匀分布于牡蛎壳粉中，然后将混合物注入模具中，将模具依次置室温，4℃ 梯度降温各1h，4℃条件下过夜，于 500Pa 负压下冻干72小时，得到牡蛎壳支架；（3）牛凝血酶溶液的制备：无菌条件下将 5000U 牛凝血酶加入 5ml 无菌 10%氯化钙溶液中，摇匀，备用；（4）富血小板血浆的制备：无菌条件下，用预先装有 2ml 10%柠檬酸钠抗凝剂的10ml注射器，从兔耳中央动脉内抽取 8ml血液，摇匀，置入离心管中，进行两次离心，第一次离心 200g×10min，血液分为上层的血浆和下层的红细胞两层，吸取全部血浆及上层约 1 mm高度的红细胞至另一离心管中，进行第二次离心 250g×10min，血浆分为上层的乏血小板血浆（PPP）和下层的PRP，弃去上层的PPP，剩余1.5ml液体，摇匀，即得PRP，将PRP储存于‑70℃条件中备用；（5）兔 MSCs 的分离、培养、扩增和诱导：0.1ml/kg肌肉注射麻醉兔后，无菌条件下切取两侧髂骨，将其置入盛有 10ml DMEM完全培养液的小瓶中，剪碎，吹打，使骨髓充分析出，然后将液体分装、移入培养皿中，再加入上述的DMEM完全培养液，置入孵箱内，在饱和湿度、37ºC、5%CO2条件下孵育，第二天换液，清除未贴壁细胞及碎骨块，以后每 2 天换液 1 次，细胞长满 80%时，0.25%胰酶消化、传代，待第二代细胞长满至 80%时，加入DMEM诱导培养液培养，待细胞长至 90‑100%时，以 0.25%胰酶消化、离心、计数，制备成细胞浓度为 1.0×10⁷/ml的细胞悬液，备用；（6）MSCs 和 PRP 在牡蛎壳支架上的种植和体外培养：取 50μl细胞浓度为 1.0×10⁷/ml的MSCs悬液与 50μl同一供体来源的PRP混合，摇匀，将此混合液体滴加到牡蛎壳圆片上，再滴加 10μl的牛凝血酶溶液，形成牡蛎壳/MSCs/PRP骨组织支架材料。