一种PD-1/CTLA-4双特异性抗体的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体的制备方法及其应用。本发明通过基因工程技术以单链抗体基因为模板，以特定的高效扩增引物，通过PCR和Overlap PCR，并向抗体的可变区引入二硫键制备PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体片段，并将该基因片段克隆到慢病毒表达载体，通过转染293T细胞进行病毒包装；然后进行CIK细胞的转导，从健康人外周血分离PBMC，用CD3/CD28磁珠刺激T细胞生长，慢病毒与T细胞共培养，得到能够阻断肿瘤及肿瘤微环境来源的免疫抑制信号，同时增强杀伤癌细胞的功能的新型抗肿瘤T细胞。

主权项

一种PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体基因片段的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，以抗PD‑1 dsFv基因为模板，扩增基因片段PD‑1 V_H‑GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.2所示；步骤二，以抗CTLA‑4 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS‑CTLA‑4 V_L，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.4所示；步骤三，Overlap PCR拼接步骤一和步骤二所得基因片段PD‑1 V_H‑GGGGS和GGGGS‑CTLA‑4 V_L，构建基因片段PD‑1 V_H‑GGGGS‑CTLA‑4 V_L，扩增引物序列如SEQ NO.1和SEQ NO.5所示；步骤四，以抗CTLA‑4 dsFv基因为模板，扩增基因片段CTLA‑4 V_H‑GGGGS，上下游扩增引物序列如SEQ NO.6和SEQ NO.2所示；步骤五，以抗PD‑1 dsFv基因为模板，扩增基因片段GGGGS‑PD‑1 V_L，上下游扩增引物序列如SEQ NO.3和SEQ NO.8所示；步骤六，Overlap PCR拼接步骤四和步骤五所得基因片段CTLA‑4 V_H‑GGGGS和PD‑1 V_L‑GGGGS，构建基因片段CTLA‑4 V_H‑GGGGS‑PD‑1 V_L，扩增引物序列如SEQ NO.7和SEQ NO.8所示；步骤七，Overlap PCR拼接步骤三和步骤六所得基因片段PD‑1 V_H‑GGGGS‑CTLA‑4 V_L和CTLA‑4 V_H‑GGGGS‑PD‑1 V_L，构建基因片段PD‑1 V_H‑GGGGS‑CTLA‑4 V_L‑furin‑GSGS‑2A‑CTLA‑4 V_H‑GGGGS‑PD‑1 V_L，即得到PD‑1/CTLA‑4双特异性抗体基因片段，其中，2A选自具有自剪切功能的F2A、E2A或T2A。