梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及一种梅花鹿鹿茸胸腺素β10重组蛋白及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。所述方法包括鹿茸胸腺素β₁₀基因的克隆、原核表达载体pET-28a-Tβ₁₀的构建、在宿主菌E.coli BL21中的诱导表达、重组蛋白的分离纯化等步骤。本发明利用基因工程技术首次尝试了对梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的原核表达，成功构建了其原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化步骤简便、快捷。经体外活性研究发现，梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白对成骨细胞M3T3有明显的促增殖作用。

主权项

一种梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白的制备方法，该梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，包括如下步骤：（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA，设计及合成胸腺素β₁₀特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGATGGCAGACAAGCCCGACAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGTCACTTTGCTTGCTTCTCCT—3′，通过RT‑PCR方法扩增得到胸腺素β₁₀基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为129bp，与载体pMD18‑T连接，获得重组载体pMD18‑T‑Tβ₁₀，将其转化至E.coliDH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证；（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀原核表达载体的构建：用EcoR I和Sal I将测序正确的重组载体pMD18‑T‑Tβ₁₀和表达载体pET‑28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coliBL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证；（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₁₀的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET‑28a‑Tβ₁₀转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G‑25凝胶层析脱盐，收集脱盐后的样品，冷冻干燥即得。