白芨外植体的无菌化处理方法

摘要

本发明涉及中草药栽培技术领域，具体来说是一种白芨外植体的无菌化处理方法，步骤包括，采挖、沙培和无菌处理。本发明方法人为机械组织损伤较小，有效保存了植株组织完整性；组培过程中，植株的褐化、玻璃化较传统培养明显减少，有效节约了由褐化、玻璃化导致的大量经济损失，明显提高了该领域的工作效率；随着组培继代次数的增加，植株个体遗传性状稳定，增值效果明显；由于无菌化处理后，外植体菌体感染率有效控制在2.5％以内，显著低于传统的30～50％；经过该技术步骤的处理，为人为有效选取茁壮、健康的白芨种源提供了前提保障。组培后期的种苗：根茎叶茁壮、种球膨大明显、大田移栽成活率在95.67％以上，后期生长势头显著。

主权项

白芨外植体的无菌化处理方法，其特征在于，步骤如下：(1)野外植株采挖：野外选取块茎生长匀称的种球，保留完整的根、茎、叶，清水洗净、标号登记、装入纸袋中置于阴暗环境下，待种球根系变白；(2)将所采植株进行沙培①沙培材料提前2～3天准备，清水洗净滤干，将所需用量的沙子进行高温灭菌，灭菌温度控制在121～126℃，灭菌35min，冷却后，平铺于培养苗床，砂体厚度控制在6cm，以备待用；②培养期间进行日常管理调节砂体pH值在5.6～5.8；喷施质量浓度为1‰的白芨专用营养液至砂体湿润即可，砂体湿度控制在60％，调节培养环境的光照在1500～2600lx，温度在20～25℃；③培养第一天，利用质量浓度为1‰甲基托布津喷施植株至完全湿润，培养床上方悬挂黄色板，并保持空气流通，3～4天后，依次用质量浓度为3～8‰吐温，质量浓度为0.1～1.5‰KMnO₄溶液进行根、茎、叶喷施5min后，再用同浓度试剂分别浸泡2.5min，各处理1次后待用；所述白芨专用营养液由NH₃NO₃、Ca₃(PO₄)₂、K₂SO₄、KCl和KH₂PO₄配制成氮重量百分比为10～15％、磷重量百分比为10～15％、钾重量百分比为15～25％的水溶液；(3)将(2)中的处理植株放入无菌白芨液态营养液中培养3～5天时间，之后用质量浓度为0.5～2‰的链霉素和质量浓度为1～3％次氯酸钠每间隔20h进行交替浸泡，共计进行3～6次即可，每次10～30min；所述白芨液态营养液由NH₃NO₃、Ca₃(PO₄)₂、K₂SO₄、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、K₂HPO₄、Ca(NO₃)₂、CaCl₂、H₂BO₃、KI、CoCl₂、FeC₆H₅O₇·NH₄OH、TDZ、BA、NAA、FeSO₄·7H₂O 和CuSO₄·5H₂O配制成氮重量百分比为8‑13％、磷重量百分比为7‑14％、钾重量百分比为15‑25％的水溶液；(4)将步骤(3)所得植株切去根、叶放入无菌液态培养液中进行2～3天摇床无菌环境培养；①将(3)中所得植株用无菌水清洗3～6次后，浸泡于无菌水中，放于无菌操作台上备用；②用无菌镊子、手术剪、手术刀、接种盘，完全切除白芨种球以外的其他部分，每处理一棵苗，换一次镊子、手术剪、手术刀以及接种盘；③将切好的白芨种球分别放入准备好的无菌白芨液态培养液中，每瓶4～6颗，然后放入无菌环境中进行2～3天摇床培养；(5)除部分感菌种球重复步骤(4)1～2次后，依次用质量浓度为3～8‰的吐温、质量浓度为0.1～1.5‰KMnO₄溶液、质量浓度为1～3％碱性次氯酸钠溶液，进行间隔10h的球茎浸泡处理1～2次后，用无菌水少量多次洗净待用；(6)将植株浸泡于1～10％无菌抗坏血酸溶液中20min后，取出植株到固态培养基中进行无菌培养，即达到无菌化处理要求。