一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因、植物表达载体及其构建方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因，其筛选两种病毒基因组范围内的共同保守区域，分别针对PRSV和PLDMV的复制酶Nib和辅助成分蛋白基因Hc-Pro，按照PRSV-Nib1-PRSV-Nib2-PLDMV-Nib1-PLDMV-Nib2-PRSV-Hc-Pro-PLDMV-Hc-Pro的排列顺序，连接成总长为621 bp的基因序列，如SEQ ID NO.1所示。本发明还涉及一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表达载体及其构建方法，所述的植物表达载体可用于基因枪或农杆菌介导的遗传转化，创造高效、广谱同时抗PRSV和PLDMV病毒病的新种质。所述方法用于构建RNAi表达载体时，能简化实验步骤，节省实验时间，并且提高RNAi植物表达载体的抗病毒效率。

主权项

一种同时靶标番木瓜病毒PRSV和PLDMV的嵌合基因的植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1）首先以嵌合基因为模板，用高保真Taq酶进行PCR反应获得两个长度不同的长片段和短片段；为使用酶切鉴定的方法判断短片段的插入方向，在短片段的正向引物中插入NcoI位点；在长片段的正反向引物中分别添加酶切位点EcoRI和KpnI，使长片段定向插入pMD18‑T载体上的EcoRI和KpnI 之间；2）短片段和长片段与克隆载体连接，分别命名为pMD18‑S和pMD19‑L；分别用EcoRI 和KpnI对pMD19‑L和pMD18‑S进行双酶切后，回收pMD19‑L的小片段和pMD18‑S的大片段；两个片段连接转化形成含有目的发夹结构的克隆载体，命名为pMD18‑LS；用EcoRI和SalI 对pMD18‑LS进行双酶切，回收含有发夹结构的小片段并与经同样双酶切的克隆载体pRTL‑SalI的大片段连接，构建成中间载体pRTL‑LS；pRTL‑LS经PstI单酶切回收含发夹结构的目的片段，与载体质粒pSW4i经PstI酶切后的回收产物连接，经电泳检测并测序验证RNAi植物表达载体pSW‑LS构建成功；步骤1）具体如下：首先以嵌合基因为模板，用高保真Taq酶进行PCR反应获得不同长度的正反向序列，为运用酶切鉴定短片段的插入方向，在短片段的正向引物插入NcoI位点；为便于长片段的定向插入，在引物中分别设计了EcoRI和KpnI 两个酶切位点，引物如下：短片段：PRSV‑Nib 573Fb‑NcoI： CCCATGG CCTCTCGACACTTTGTTGGGAG           NcoIPLDMV‑HC1037Rb：GATCCAATAACCTTCCTTAGCCACAATCA基因大小530bp；长片段：PRSV‑Nib 608Fa‑EcoRI：CATGGAATTCTGATGATTTCAATAATTGGTTCTACAGC             EcoRIPLDMV‑HC1118R‑KpnI：CGGGGTACCTTATATCTCTAACCTTCTTTGTG             KpnI基因大小598bp；所述嵌合基因具体为：通过对GenBank中危害番木瓜的两种病毒PRSV和PLDMV的多条基因组全长基因组序列进行比对，筛选两种病毒基因组范围内的共同保守区域，分别针对PRSV和PLDMV的复制酶Nib和辅助成分蛋白基因Hc‑Pro，按照PRSV‑Nib1‑PRSV‑Nib2‑PLDMV‑Nib1‑PLDMV‑Nib2‑PRSV‑Hc‑Pro‑PLDMV‑Hc‑Pro的排列顺序，连接成总长为621 bp的基因序列，如SEQ ID NO.1所示。