一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法

摘要

本发明公开了一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法，石斛开花后采取人工方法授粉，将成熟的石斛蒴果经消毒后切开把种胚接种到萌发培养基上培养形成原球茎，然后转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系。将悬浮细胞接种到含有酶解液的液体培养基中进行酶解处理获得原生质体，供体原生质体用γ-射线处理，受体原生质体用碘乙酰胺进行处理，然后用聚乙二醇法进行原生质体融合。融合产物转入原生质体液体培养培养，将获得细胞团转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。本发明简单易行，融合频率高，可大幅度地拓宽了石斛的遗传多样性，为石斛杂交育种、遗传改良和新种质创造开辟了一条新途径。

主权项

一种基于不对称原生质体杂交技术的石斛种质的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：1)人工授粉：按常规方法进行栽培管理，选定株系优良的石斛植株作为亲本，在石斛开花后进行异花授粉；2)非共生萌发：在石斛蒴果发育基本成熟而果实未开裂时，消毒后，用无菌解剖刀沿蒴果纵轴方向将蒴果切开，将种胚接种到萌发培养基上在温度为25～28℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天的条件下培养，培养20～30天后种子萌发成原球茎；3)悬浮培养：将非共生萌发形成的原球茎转入液体诱导培养基进行振荡悬浮培养得到悬浮细胞系；所述的液体诱导培养基为：MS+6‑BA0.5～1mg/L+NAA0.3mg/L+土豆汁100ml/L+白糖30g/L；4)原生质体游离：将悬浮细胞接种到含有酶解液的原生质体液体培养基中，在25～28℃、黑暗条件下进行间歇振荡酶解处理10～20小时；5)原生质体的的处理：将游离的石斛受体原生质体先用碘乙酰胺溶液避光处理10～20min，然后用原生质体洗涤液冲洗3～5次，再用原生质体液体培养基稀释至10⁵～10⁶个/mL；供体原生质体先用原生质体液体培养基稀释至10⁵～10⁶个/mL，然后铺在直径1.5cm的玻璃培养皿中形成薄层用γ‑射线处理；6)原生质体的不对称融合：将供体原生质体与受体原生质体按体积比1：1进行混合均匀，用聚乙二醇融合法进行融合；7)类原球茎的诱导与植株再生：融合产物转入原生质体液体培养基进行振荡培养获得细胞团，然后转接到诱导培养基上进行培养即获得完整的体细胞杂种植株。